淫羊藿炮制前后在大鼠体内的药代动力学研究

周一帆，胡昌江，张雪洁，余凌英，陈 琳，高 源

(成都中医药大学药学院，四川成都 611137)

淫羊藿为小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim的干燥叶，始载于《神农本草经》，具有补肾阳，强筋骨，祛风湿的功效［1］。羊脂油炙淫羊藿，最早记载于《雷公炮炙论》［2］，为临床常用的炮制品。淫羊藿生品功效侧重于祛风湿，而经羊脂油炙后功效侧重于温肾壮阳。黄酮类化合物是淫羊藿的有效成分，其中以淫羊藿苷为主的多种以异戊烯基黄酮为母核的结构类似化合物为其主要成分。药物在体内的代谢过程在一定程度上对药效有影响［3-7］。本实验旨在通过比较生、炙淫羊藿中淫羊藿苷在大鼠体内的代谢过程的差异，为系统性的研究淫羊藿炮制前后功效变化奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪(美国Agilent，型号1200)，单四级杆质谱(美国Agilent，型号6120)电子天平(德国SARTORIUS，型号BD61，感量为0.1 mg);高速离心机(上海安亭科学仪器厂，型号TGL-16B)。

1.2 试药 淫羊藿苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号110737-200415，供含量测定);槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所，批号081-9033，供含量测定)。淫羊藿药材(购于成都新荷花药材市场)，经成都中医药大学卢先明教授鉴定为小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim干燥叶;乙腈(色谱纯，美国sigma公司)，其余试剂为分析纯;水为超纯水。

1.3 实验动物 SD大鼠，清洁级，雄性，体质量(220±10)g，购于四川达硕实验动物中心，动物合格证号SCXK(川)2008—24。

2 方法与结果

2.1 淫羊藿药液的制备 炙淫羊藿由实验室自行炮制(炮制温度为160℃，炮制时间7 min，每100 g淫羊藿加羊脂油20 g)［8］，生、炙淫羊藿经高效液相检测淫羊藿苷量为1.12%和1.29%。取生淫羊藿173 g、炙淫羊藿150 g分别12倍70%乙醇回流提取两次，每次1.5h。药液减压浓缩至100 mL［9］。生淫羊藿药液质量浓度1.73 g/mL(相当于淫羊藿苷19.37 mg/mL)，炙淫羊藿药液质量浓度1.50 mg/mL(相当于淫羊藿苷19.35 mg/mL)。

2.2 血浆样品处理［10-12］分别取血浆0.2 mL置1.5 mL离心管中，加入适量内标溶液1 mL乙酸乙酯涡旋混合5 min，离心10 min(8000 r/min)，取上清液。残渣再加入1 mL乙酸乙酯重复操作一次，合并两次上清液。置于40℃下氮气吹干后加入200μL甲醇，涡旋混合 5 min，离心 10 min(12000 r/min)，吸取上清液进样分析。

2.3 分析方法的建立

2.3.1 色谱条件 Diamonsil钻石二代C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm);以乙腈－0.1%甲酸溶液(30∶70)为流动相;体积流量1.0 mL/min;柱温30℃。

2.3.2 质谱检测条件 电喷雾离子源(ESI)，正离子模式，干燥器流量12 L/min，温度350℃，SIM模式下选择质荷比(m/z)677与303离子进行检测。

2.3.3 对照品及内标物溶液的制备 精密称取淫羊藿苷对照品加甲醇配置成0.418 mg/mL的贮备液，精密称取槲皮素对照品加甲醇配置成1.54μg/mL的贮备液，备用。

2.3.4 专属性考察 将空白血浆、空白血浆中加入淫羊藿苷及给药后大鼠血浆样品按照2.3项下血浆样品处理方法处理后进行测定。结果显示在选定的条件下，空白血浆中的内源性物质对淫羊藿苷的测定无干扰，见图1。

2.3.5 标准曲线的绘制 精密吸取0.418 mg/mL的淫羊藿苷对照品溶液适量，用空白大鼠血浆分别配 置 成 0.209、0.418、0.836、1.672、2.508、3.344μg/mL的系列空白血浆对照品溶液200μL，依照2.2项下方法处理样品后进样分析，以质量浓度(μg/mL)为纵坐标Y，淫羊藿苷与内标物峰面积比为横坐标X，绘制标准曲线，计算回归方程为Y=1.6142 X+0.0871，r2=0.9996。结果表明淫羊藿苷在0.209～3.344μg/mL范围内线性关系良好。

2.3.6 精密度与回收率试验 取淫羊藿苷贮备液，加入空白大鼠血浆配制成含质量浓度分别为0.3、1.5、3.0μg/mL的血浆样品，依照2.2项下方法操作与测定，每一浓度平行测定5次，每一质量浓度连续测定5 d。计算日内精密度和日间精密度。另外，将血浆样品测得的浓度与血浆实际浓度比较，计算相对回收率。结果显示高、中、低浓度血浆中淫羊藿苷日内精密度RSD分别为5.16%、5.58%、4.87%;日间精密度RSD分别为6.59%、5.53%、4.83%。高、中、低浓度血浆中淫羊藿苷平均回收率为88.4%、93.1%、85.6%。

2.4 大鼠药代动力学试验 取雄性SD大鼠12只，随机分两组，分别按体质量灌胃给予生淫羊藿药液(34.6 g/kg)、炙淫羊藿药液(30 g/kg)，相当于淫羊藿苷387 mg/kg。实验前12 h禁食，自由饮水。在给药前及给药后 5、15、30、60、90、120、240、360、480、720 min分别后眼眶静脉丛取血0.5 mL，置于预先肝素化的离心管中，6000 r/min离心10 min，取上层血浆0.2 mL放入－20℃冰箱保存备用。

2.5 数据处理 使用DAS 2.0软件处理大鼠灌胃后各时间点的平均血药浓度(C)－时间(t)数据，自动判别模型计算药代动力学参数。DAS 2.0软件计算得药代动力学参数见表1，大鼠血浆中淫羊藿苷的血药浓度-时间曲线见图2。

表1 生、炙淫羊藿药代动力学参数(，n=6)Tab.1 Main pharmacokinetic parameters of icariin in extract from Epimedii Folium and processed Epimedii Folium(，n=6)

表1 生、炙淫羊藿药代动力学参数(，n=6)Tab.1 Main pharmacokinetic parameters of icariin in extract from Epimedii Folium and processed Epimedii Folium(，n=6)

注:*与对照药物相比P＜0.05

参数 单位 药物生淫羊藿 炙淫羊藿Tmax h 11 Cmax mg/L 2.285±0.75 2.8±0.82*t1/2α h 0.691±0.12 4.569±0.89 t1/2β h 4.967±0.56 5.423±0.57 V1/F L/kg 112.504±10.53 130.42±15.88 CL/F L/h/kg 23.4±6.14 15.6±3.76 AUC(0-t) mg/L·h 14.935±5.11 20.682±4.28*AUC(0-∞) mg/L·h 16.039±6.21 25.301±8.12 MRT(0-t) h 4.932±0.76 5.471±1.21 MRT(0-∞) h 6.093±0.84 9.1±2.36 Ka 1/h 1.38±0.19 1.98±0.24

图2 生、炙淫羊藿的血药浓度-时间曲线Fig.2 Concentration-time profiles of icariin in extract solutions from Epimedii Folium and processed Epimedii Folium

3 讨论

本实验对于血浆处理方法进行了考察，血浆处理的溶剂分别比较了甲醇、乙腈、乙酸乙酯处理后淫羊藿苷的回收率，最终乙酸乙酯处理后的回收率较高。血浆处理次数的比较显示，处理2次的回收率均高于处理1次，而处理3次与处理2次的回收率差异不大。氮吹温度的考察显示30、40、50℃回收率无明显的差异。血浆处理方法最后定为用乙酸乙酯处理2次后置于40℃下氮气吹干。

药时曲线经拟合显示生、炙淫羊藿中淫羊藿苷在大鼠体内药代动力学均符合二室模型。在表1与图2中可以看出，生淫羊藿组血药峰浓度(Cmax)为(2.29±0.75)mg/L，0～12 h的药时曲线下面积(AUC0-t)为(14.935±5.11)mg/(L·h)，炙淫羊藿组 Cmax升高到(2.80±0.82)mg/L，AUC(0-t)升高到(25.301±8.12)mg/(L·h)。由此可见炙淫羊藿中的淫羊藿苷在大鼠体内的吸收量有所提高，表明了炮制对于淫羊藿中淫羊藿苷在大鼠体内的吸收有一定的促进作用，炮制可提高淫羊藿中淫羊藿苷的生物利用度。淫羊藿炮制所用辅料羊脂油主要含饱和脂肪酸7种，主要是棕榈酸及硬脂酸等，不饱和脂酸9种主要是油酸，反式9-十八碳烯酸等［13-14］。脂肪酸有表明活性剂的作用可能是淫羊藿苷溶解性得到提高，从而增强了其在体内的吸收。

［1］赵国平，戴 慎，陈仁寿.中药大辞典［M］.上海:上海科学技术出版社，2005.3149-3154.

［2］王孝涛.历代中药炮制法汇典［M］.江西:南昌科学技术出版社，1998:369.

［3］吕 鹏，黄晓舞，吕秋军.黄酮类化合物吸收、分布和代谢的研究进展［J］.中国中药杂志，2007，32(19):1961-1964.

［4］邹节明，孟 杰，颜正华.中药复方有效成分淫羊藿苷的药代动力学研究［J］.中草药，2002，33(1):55-58.

［5］Li Y，Duan J，Guo T.In vivo pharmacokinetics comparisons of icariin，emodin and psoralen from gan-kang granules and ex-tracts of herba Epimedii，Nepal dock root， Ficus hirta yahl［J］.J Ethnopharmacology，2009(124):522-529.

［6］李寅超，黄兰岚，赵宜红，等.不同炼制温度和用量的羊脂油制淫羊藿对肾阳虚大鼠的影响［J］.中国中药杂志，2011，36(16):2250-2254.

［7］许青媛.淫羊藿对大鼠性腺功能的影响［J］.中药药理与临床，1996(2):22.

［8］周一帆，胡昌江，余凌英.星点设计-效应面法优选淫羊藿油炙工艺［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18(16):16-18.

［9］陶君彦，徐绍新，李志雄.淫羊藿醇提工艺条件的研究［J］.时珍国医国药，2004，15(1):11-12.

［10］钱 浅，孙 娥，樊宏伟，等.羊脂油对淫羊藿炮制品提取物中 宝藿苷 Ⅰ［J］.中草 药，2012，43(10):1981-1985.

［11］赵艳红，贾晓斌，陈 彦.淫羊藿苷大鼠在体肠吸收动力学的研究［J］.中华中医药杂志，2007，22(10):681-684.

［12］刘晓燕，王本杰，巍春敏.淫羊藿苷单体及淫羊藿总黄酮提取物大鼠药动学特征比较［J］.中国医院药学杂志，2011，31(22):1858-1863.

［13］黄兰岚，李娆娆.气相色谱法-质谱联用法分析羊脂油的脂肪酸成分［J］.时珍国医国药，2009，20(10):2488-2489.

［14］国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草:第9册［M］.上海:上海科学技术出版社，1999.