蜘蛛香野生转家种品质评价研究

郜红利，谭玉柱

(1.湖北民族学院，湖北恩施 445000;2.成都中医药大学，四川成都 611137)

蜘蛛香为败酱科植物蜘蛛香Valeriana jatamansi Jones的干燥根茎和根［1］。性味辛、苦，温，具有理气和中、散寒除湿、活血消肿的功效，主要用于治疗脘腹胀痛、呕吐泄泻、风寒湿痹、小儿疳积、脚气水肿、跌打损伤等症［2］。其化学成分主要是挥发油、环烯醚萜、黄酮及其他一些成分［3］。现代药理研究表明，蜘蛛香有镇静、催眠、抗焦虑、抗肿瘤等药理作用［4］。蜘蛛香主要分布在云南、湖北、贵州等偏远山区［5］，其中湖北恩施自治州各县市资源丰富。随着蜘蛛香药用价值的日益提高，其野生资源已难以满足市场需求，开展野生蜘蛛香转家种的研究迫在眉睫［6］，本课题组通过其根茎无性繁殖，对其野生转家种技术进行初步研究，培育了不同生长年限的栽培品，从其产量及外观性状上观察，二者并无较大差异，但是有关其栽培品的品质评价尚无定论。因此，课题组分别收集不同栽培年限的蜘蛛香与野生蜘蛛香，从其性状、鉴别、化学成分分析、指标性成分定量测定等方面进行质量评价，以期对野生品种与栽培品种进行科学评价，探讨野生转家种的可行性，也为蜘蛛香栽培技术的推广应用提供技术支持。

1 试剂与试药

1.1 仪器与试剂 Angenlent 1200高效液相色谱仪;BP121S型电子天平(北京Sartorius天平有限公司，十万分之一);显微镜(上海炳宇光学仪器有限公司)，DiamonsilC-18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5μm)。缬草三酯(纯度＞98%，成都植标化纯生物科技有限公司，110756-200110)、橙皮苷(纯度＞98%，中国药品生物制品检定研究院，110721-200512)，乙腈、甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)，超纯水(实验室自制)，其余试剂均为分析纯。

1.2 药材 实验用蜘蛛香药材分别来自湖北省恩施州利川市、宣恩县、巴东县、咸丰县、建始县等5个县市，每个县市各有栽培品与野生1个批次，共计10个批次，野生与栽培品经中药鉴定教研室朱敏英教授鉴定为败酱科植物蜘蛛香Valeriana jatamansi Jones的干燥根茎和根，来源见表1。

表1 不同批次蜘蛛香药材来源Tab.1 Sources of different batches of Valeriana jatamansi

2 方法与结果

2.1 性状

2.1.1 野生品 本品根茎呈圆形或扁圆形，略弯曲，不分叉，长3～5 cm，直径为0.5～1.6 cm，棕褐色或茶褐色，表面有绸密的环纹突起，不甚规则，底面有须根痕。芦头平截，可见茎、叶残基。质坚实，断面黄褐色。下侧具多数须根，多卷缩弯曲。味略苦、辛质坚脆，易折断，断面浅绿色。

2.1.2 栽培品 本品根茎呈扁圆柱形，略弯曲，不分叉，长2～6 cm，直径为0.6～1.7 cm，茎基残穴处稍膨大，表面褐色，表面有较绸密的环纹突起，不甚规则，底面有多数须根痕，须根多卷缩弯曲。味略苦、辛，质坚脆，易折断，断面浅绿色。栽培品种主要特点:个头较野生品大、颜色较浅、茎基残穴处膨大、底面须根甚多。

2.2 鉴别

2.2.1 显微鉴别 野生与栽培品一致。本品粉末灰褐色，置显微镜下观察发现淀粉粒众多，类圆形，脐点裂缝状，有的可见层纹;复粒由2～4粒组成。易见含黄棕色内含物与油滴的薄壁细胞碎片。根毛为单细胞与多细胞组成。木栓细胞淡黄色，多角形。导管多为网纹导管和单纹孔导管。薄壁细胞内含有橙皮苷结晶和淡棕褐色物。

2.2.2 TLC鉴别 分别取本品野生与栽培品粉末1 g，加乙醚10 mL，振摇，放置5 min，滤过，滤液挥去乙醚，残渣加甲醇0.5 mL使溶解，作为供试品溶液。另取缬草三酯对照品，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的对照溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验，吸取供试品溶液5μL、对照品溶液2μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚(30～60℃)-丙酮(5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。野生品与栽培品显色斑点没有明显差异。

2.3 化学成分比较

2.3.1 色谱条件 Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，0～20 min，10% ～55%乙腈，20～60 min，55% ～95%乙腈。体积流量0.8 mL/min，柱温30℃，检测波长254 nm。

2.3.2 色谱结果 见图1。图1中的12号峰(缬草三酯)为参照峰，野生品与栽培品化学成分比较没有明显差异，根据特征图谱共有峰标记，显著差异峰主要集中在3、4号峰，根据极性较大的黄酮类成分与极性较小的环烯醚萜类成分主要集中在图谱的首尾段，观察发现野生品与栽培品在首尾段无显著差异，说明影响其药效的主要化学成分一致，主要差异集中在中间段。

图1 野生品与栽培品的化学成分对照图谱Fig.1 Fingerprint of wild and cultivated products of Valeriana jatamansi Jones

2.4 成分测定

2.4.1 缬草三酯含有量比较

2.4.1.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-水(60∶40)为流动相;检测波长为256 nm。理论板数按缬草三酯峰计算应不低于5000。

2.4.1.2 对照品溶液的制备 取缬草三酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含缬草三酯0.1096 mg的溶液，即得。

2.4.1.3 供试品溶液的制备 分别取野生与栽培品粉末(过三号筛)约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率500 W，频率28 kHz)30 min，取出，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4.1.4 线性关系考察 分别精密吸取缬草三酯对照品2、5、10、15、20μL注入液相色谱仪，按照2.4.1.1项色谱条件下检测峰面积，同一进样体积连续测3次取平均峰面积，以进样量为横坐标x，以平均峰面积为纵坐标y进行线性回归，即得线性关系为y=194.09x+12.729，r=0.9996，线性范围为 0.2192 ～2.192μg。

2.4.1.5 精密度考察 取同一份对照品溶液，按2.4.1.1项中色谱条件，连续进样5次，计算缬草三酯峰面积RSD为2.34%(n=5)。

2.4.1.6 稳定性考察 将“批次1”供试品溶液室温下放置，分别于第0、2、4、6、8、12 h进样测定，计算缬草三酯色谱峰峰面积RSD值为2.40%(n=5)，表明缬草三酯在12 h内稳定。

2.4.1.7 加样回收率试验 分别称取6份供试品约0.5 g，加入与“批次1”供试品缬草三酯含有量相当的同一对照品溶液，分别制备6份样品。分别测定，平均加样回收率为100.93%，RSD为3.37%(n=6)。

2.4.1.8 样品测定 称取不同来源的野生品与不同生长年限的栽培品蜘蛛香药材粉末各2 g，按照2.4.1.3项下供试品制备方法制备，依次进样10μL，按照2.4.1.1项色谱条件测定各供试品峰面积，外标法计算。图谱见图2。

图2 缬草三酯HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatogram of valepotriate

2.4.2 总黄酮与总缬草三酯量比较

2.4.2.1 标准曲线的制定 准确称取橙皮苷和缬草三酯对照品适量，分别加甲醇溶解配制成质量浓度为0.1106 mg/mL和0.1096 mg/mL的标准溶液。分别移取上述标准液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，以甲醇作空白，分别于最大吸收波长284 nm和256 nm处测吸光度。以吸光度A对标准溶液质量浓度C作图，即得标准工作曲线分别为Y=0.035x－0.006，r=0.9993，线性范围为 5.53～27.65μg/mL;Y=31.427x+0.0372，r=0.9992;线性范围为2.19 ～27.4μg/mL。

2.4.2.2 供试品的制备及测定 分别称取2 g已脱脂和未脱脂处理的野生和栽培蜘蛛香粉末各3批次，分别加入50 mL甲醇溶剂，密塞，摇匀，超声提取1次，30 min/次，取出放冷，离心分离，取上清液于旋转蒸发器上浓缩至干，加30 mL甲醇溶解，滤去不溶物，滤液加甲醇定容至50 mL，即得总黄酮和缬草三酯供试品溶液。分别移取0.2 mL供试品溶液，加甲醇定容至10 mL，以甲醇作空白，分别于284 nm和256 nm处测吸光度。并根据标准曲线计算蜘蛛香总黄酮和缬草三酯量。

2.4.2.3 精密度考察 取橙皮苷和缬草三酯对照品适量，以甲醇作空白，分别于284 nm和256 nm处测吸光度，连续测定5次，计算橙皮苷和缬草三酯RSD分别为3.14%和2.89%(n=5)。

2.4.2.4 稳定性考察 将橙皮苷和缬草三酯对照品溶液室温下放置0、2、4、6 h，以甲醇作空白，分别于284 nm和256 nm处计算橙皮苷和缬草三酯对照品吸光度的RSD值，分别为1.98%和1.87%(n=4)，表明橙皮苷和缬草三酯在6 h内稳定。

2.4.2.5 加样回收试验 称取“批次1”已知总黄酮和总缬草三酯含有量的蜘蛛香供试品6份，分别加入等量的橙皮苷和缬草三酯对照品，以甲醇作空白，分别于284 nm和256 nm处测吸光度，计算平均加样回收率分别为96.31%和95.74%，RSD分别为3.34%和3.21%(n=6)。

2.4.3 测定结果 见表2。

表2 蜘蛛香野生品与栽培品指标性成分含有量比较Tab.2 Content determination of wild and cultivated products of Valeriana jatamansi

综上，蜘蛛香栽培品的总黄酮、缬草三酯类成分含有量均高于野生品。

3 结论

3.1 野生蜘蛛香与栽培蜘蛛香的外观性状无明显差异，显微和薄层鉴别亦未发现明显差异，其特征化学成分分析共有峰均存在，仅在中间段3、4号共有峰上有明显不同，提示野生品较栽培品化学成分复杂，但是差异成分是否是其活性成分还有待商榷;野生品与栽培品的指标性成分含有量比较发现，总黄酮和缬草三酯量后者均高于前者。综上，蜘蛛香栽培品品质在指标性成分含有量上优于野生品。

3.2 蜘蛛香总黄酮是其抑菌、抗肿瘤作用的主要药效成分［7］，橙皮苷是蜘蛛香黄酮类的主要化学成分［8］，利用它作为标准测定总黄酮不仅测定准确而且具有衡量其质量的意义，已有研究表明家种蜘蛛香中橙皮苷量较野生蜘蛛香高，提示其野生转家种的可行性［9］。缬草三酯类成分具有抗肿瘤、镇静催眠、抗焦虑、解痉等多种药理活性［10］，是其主要活性成分及质量控制指标［11］，蜘蛛香中缬草三酯类成分量的测定方法主要有电位滴定法［12］、比色法［13］、酸碱滴定法［14］。利用紫外分光光度法测定蜘蛛香中总缬草三酯量，方法准确、快速、重复性好、操作简便［7］。蜘蛛香药材集中九月采集，主要是考虑缬草三酯类成分在九月药材中含有量较高［15］。本课题基于性状鉴别、化学成分比较、指标性成分量比较等方面对蜘蛛香野生品与栽培品品质进行系统评价，为蜘蛛香野生转家种品质评控提供重要科学依据，证实了野生转家种的可行性，同时该项目的开展将极大缓解其资源匮乏的现状，有效保护蜘蛛香野生资源，有利于中药资源的可持续开发利用。

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