柠檬催化转化原人参二醇组皂苷制备人参皂苷Rg5的初步研究

孙成鹏，高维平，赵宝中，成乐琴*

(1.东北师范大学化学学院，吉林 长春 130024;2.吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022)

人参Panax ginseng C.A.Meyer属五加科草本植物，我国重要名贵药材，其应用有超过4000年的历史［1］。人参皂苷是人参的主要活性成分之一，现代药理研究表明，人参皂苷具有抗衰老、抗肿瘤、抗自由基、保护神经和保护心血管等作用［2-9］。

人参皂苷Rg5最初从红参中分离得到［10］，属次级人参皂苷，是原人参二醇组皂苷(PPD)的代谢产物。人参皂苷Rg5具有抗接触性皮炎［11］、抗肿瘤［12］、抑制环氧合酶-2［13］和改善肺部炎症［14］等作用，特别在改善记忆力方面，其药效远优于人参皂苷 20(S)-Rg3 和 20(R)-Rg3［15］。由于人参皂苷Rg5的制备和分离难度较大［16］，在其制备过程中，生成副产物较多，如人参皂苷Rk1和Rz1，同时其分离仅可以通过制备型高效液相色谱和高速逆流来实现，故有关人参皂苷Rg5的制备及其药理研究报道较少，目前，仅有炮制人参和专利［17］两种方法，但上述方法产率很低，因此有必要开发人参皂苷Rg5的制备方法。

本实验选用生物质材料柠檬为催化剂，PPD皂苷为原料，低成本环境友好地制备高附加稀有人参皂苷Rg5(图1)，结合硅胶柱层析和半制备型高效液相色谱分离人参皂苷 Rg5和 Rk1，并通过HPLC、1H-NMR和13C-NMR进行定量分析和结构鉴定。

1 材料

人参皂苷对照品 Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、20(S)-Rg3和20(R)-Rg3购自成都曼斯特公司;PPD皂苷自制(纯度为98.51%，其中人参皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3和 Rd的含有量分别为48.60%、19.11%、16.95%、4.72%和9.13%);人参皂苷对照品Rg5为自制(根据峰面积归一化法测得其纯度为99.33%);蒸馏水自制，乙醇、丙酮为分析纯，乙腈和甲醇为色谱纯。

图1 人参皂苷Rg5的制备方案Fig.1 Method of preparation of ginsenoside Rg5

P230P型高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司);JJ—1大功率电动搅拌器(常州国华电器有限公司);DK—98—Ⅱ型恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)。

2 方法

2.1 稀有人参皂苷Rg5和Rk1的制备 向原人参二醇组皂苷溶液(20 mg/mL)中加入80%的柠檬汁水溶液(1∶2.5，V∶V)，于100℃反应2 h。反应产物经饱和碳酸钠中和后，用水饱和正丁醇萃取5次，合并有机层，于50℃旋转蒸发仪蒸干。残留物甲醇溶解(4 mL)，0.45μm滤膜过滤，进行HPLC定量分析。

2.2 稀有人参皂苷Rg5和Rk1的分离 将上述反应产物做成样品胶，以三氯甲烷-甲醇为洗脱剂(8.5∶1.5，V/V)，利用硅胶柱层析分离得到人参皂苷Rg5、Rk1和Rz1的混合物。将上述混合物溶于甲醇，经半制备型高效液相色谱 ［Hypersil C18，250 mm×20 mm，10μm，乙腈-水(39 ∶61)，15 mL/min］分离得到三个馏分，分别为化合物1(27.5 mg)、2(18 mg)以及2和3的混合物(20.5 mg)。

2.3 HPLC分析

2.3.1 有机酸测定 将柠檬用榨汁机榨成汁，冷冻杀菌，放置于冰箱内储存。取1 mL柠檬汁加入蒸发皿中，于70℃蒸干。残留物用80%乙醇溶解(8 mL)，经离心和滤膜(0.45μm)过滤，用于HPLC分析。Damonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，二极管阵列检测器，进样量 20μL，柱温30℃，体积流量 0.8 mL/min。流动相为0.1%磷酸水溶液。HPLC分析结果，见图2。

图2 柠檬中有机酸HPLC谱图Fig.2 HPLC analyses of organic acids in lemon

由图2可知，柠檬中主要含有柠檬酸和苹果酸，且柠檬酸的量远大于苹果酸。HPLC定量分析表明，柠檬中苹果酸的量为0.14 mg/mL，柠檬酸的量为20.20 mg/mL，其含有量为苹果酸的144倍，且柠檬的pH为2.46，酸性较强，因此，可用其代替传统HCl、H2SO4和HAc等催化剂，用于人参皂苷Rg5的制备。

2.3.2 反应产物测定 YMC J'sphere ODS-H80色谱柱(4.6 mm×250 mm，4μm)，UV检测器，检测波长为203 nm，进样量20μL，柱温30℃，体积流量1 mL/min。流动相A为乙腈，B为水。梯度洗脱程序:0～30 min，30% ～40%A;30～37 min，40% ～50%A;37～45 min，50% ～51%A;45～60 min，51% ～55%A;60～60.10 min，55% ～90%A;60.10～75 min，90%A;75～75.10 min，90% ～30%A。HPLC分析结果，见图3。

图3 人参皂苷对照品(A)和反应产物(B)的局部HPLC谱图Fig.3 HPLC profile analysis of refer ginsenosides(A)and reaction product(B)

图3-A为人参皂苷对照品的HPLC分析图，人参皂苷 Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3和Rg5的保留时间分别出现在16.3、18.2、 20.2、 21.1、 25.2、 43.5、 44.4、 58.2 min。图3-B为反应产物的HPLC分析图，与图3-A相比，保留时间在15 min～28 min之间没有出现任何信号峰，说明原料人参皂苷 Rb1、Rc、Rb2、Rb3和Rd均已完全转化。由图3-A可知，人参皂苷Rg5的信号峰出现在保留时间58.2 min，图3-B中，保留时间在56.4 min处出现的信号峰，推测为人参皂苷 Rk1与 Rz1［18］混合物，而保留时间58.3 min出现的信号峰可以认定为人参皂苷Rg5，对其定量分析结果表明，收率为30.77%，得率为21.53%。

3 结构鉴定

将化合物1和2溶于氘代吡啶，采用BRUKER AVANCEⅡ核磁共振仪(Switzerland，500 MHz)测定上述两种化合物的1H-NMR和13C-NMR。

化合物1:白色粉末(乙腈);1H-NMR(pyridine-d5，500MHz) δ:0.85(3H， s，-CH3)，0.99(3H， s，-CH3)，1.05(3H， s，-CH3)，1.13(3H， s，-CH3)，1.32(3H， s，-CH3)，1.61(3H， s，-CH3)，1.65(3H， s，-CH3)，1.84(3H，s，-CH3)，3.31(1H，dd，J=4.0 Hz，C3-H)，3.94(1H，s，C12-H)，4.94(1 H，d，J=7.5 Hz，C1'-H)，5.38(1 H，d，J=7.5 Hz，C1″-H)，5.25(1H，t，C24-H)，5.53(1H，t，C22-H);13C-NMR结果见表1。

化合物2:白色粉末(乙腈);1H-NMR(pyridine-d5，500MHz) δ:0.83(3H， s，-CH3)，0.98(3H， s，-CH3)，1.03(3H， s，-CH3)，1.13(3H， s，-CH3)，1.32(3H， s，-CH3)，1.61(3H， s，-CH3)，1.68(3H， s，-CH3)，3.31(1H，dd，J=4.0 Hz，C3-H)，3.94(1H，s，C12-H)，4.96(1H，d，J=7.5 Hz，C1'-H)，5.41(1 H，d，J=7.5 Hz，C1″-H)，4.93(1H，s，C21-H)，5.17(1H，s，C21-H)，5.30(1H，t，C24-H);13C-NMR结果见表1。

在化合物1的1H-NMR中，δ 0.85～1.84分别出现了C-19、C-30、C-18、C-29、C-28、C-27、C-26和C-21的8个-CH3氢信号峰，δ 5.25和5.53分别为C-24和C-22的双键氢的信号峰。在化合物1的13C-NMR中，共出现42个碳信号峰，其中 δ 105.44和106.37为两个糖端基碳信号峰，δ 140.54、123.65、124.05和 131.62分别为 C-20、C-22、C-24和C-25的双键碳信号峰，而其他1HNMR和13C-NMR数据与文献 ［19］基本一致，故化合物1鉴定为人参皂苷Rg5。

化合物2是在制备人参皂苷Rg5过程中副产的次级人参皂苷，其1H-NMR的数据与化合物1基本相似，只是在δ 0.83～1.68之间只有7个-CH3氢信号峰，分属于 C-19、C-30、C-18、C-29、C-28、C-27和C-26的-CH3的氢。此外，由于C-21双键碳上亚甲基的两个氢所处化学环境不同，存在有两个信号峰，分别在δ 4.93和5.17;另一个双键碳(C-24)的氢信号峰出现在δ 5.30。在化合物2的13C-NMR中，化合物2的C-20、C-21和C-22与化合物1存在着明显不同，其信号峰分别出现在δ155.91，108.48和 34.24。化合物 2的其他1HNMR和13C-NMR数据与文献［19］基本一致，故化合物2鉴定为人参皂苷Rk1。

4 人参皂苷Rg5的反应机理

从图4可以看出，PPD转化为人参皂苷Rg5的途径为PPD→Rg3→Rg5，同时生成副产物人参皂苷Rk1和Rz1。PPD皂苷在酸性条件下，首先生成人参皂苷Rg3，再进一步脱水生成人参皂苷Rg5及其副产物。由于人参皂苷Rg3在水中溶解度很低进而形成沉淀，阻碍了人参皂苷Rg3进一步脱水。此外，人参皂苷Rg3在脱水过程中，存在着3种不同的脱水方式，分别生成人参皂苷Rg5(脱水方式符合扎伊切夫规则，E-构型)，人参皂苷 Rk1(脱水方式符合霍夫曼规则)和Rz1(脱水方式符合扎伊切夫规则，Z-构型，与人参皂苷Rg5属于顺反异构体)。然而，在上述3种产物中，由于人参皂苷Rg5的脱水方式符合扎伊切夫规则，同时其构型为E-构型，属于优势构象，故其在3种产物中产率较高。从上述分析结果可以看出，若能提高中间产物人参皂苷Rg3溶解度和其脱水的选择性，人参皂苷Rg5的收率势必将有质的提高。

图4 人参皂苷Rg5的反应机理Fig.4 Reaction mechanism of ginsenoside Rg5

5 结论

稀有人参皂苷Rg5为PPD皂苷的次级代谢产物，在抗肿瘤、改善记忆力和抗接触性皮炎等方面疗效显著。由于人参皂苷Rg5的中间体人参皂苷Rg3在水中溶解度较小，而给其制备带来了一定的难度，故有关人参皂苷Rg5制备及药理活性研究报道较少。实验结果表明，PPD皂苷溶液经柠檬汁处理，人参皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3和 Rd的转化率达到100%，人参皂苷Rg5收率为30.77%，得率为21.53%。与专利方法［17］相比，人参皂苷Rg5的制备不需任何气体(氮气)保护，操作简单，反应时间短，相对于专利缩短了22 h，同时其得率提高了6.83%。这对于研究人参皂苷Rg5的药理活性及开发相关保健品具有重要参考价值。

［1］孙光芝，刘 志，张俊杰.人参二醇组皂苷的药理学研究概况［J］.有机农业与食品科学，2005，21(2):136-140.

［2］包海鹰，李 磊，昝立峰，等.黑根霉对人参皂苷Re的生物转化［J］.菌物学报，2010，29(4):548-554.

［3］Leung K W，Yung K K，Mak N K，et al.Angiomodulatory and neurological effects of ginsenosides［J］.Curr Med Chem，2007，14(12):1371-1380.

［4］Yue P Y，Mak N K，Cheng Y K，et al.Pharmacogenomics and the Yin/Yang actions of ginseng:anti-tumor，angiomodulating and steroid-like activities of ginsenosides［J］.Chin Med，2007，2:6.

［5］Kang K S，Yokozawa T，Yamabe N，et al.ESR study on the structure and hydroxyl radical-scavenging activity relationships of ginsenosides isolated from Panax ginseng C.A Meyer［J］.Biol Pharm Bull，2007，30(5):917-921.

［6］王国贤，肖志洁，宗瑞义.人参二醇皂甙对小鼠急性脑缺血损伤的保护作用［J］.锦州医学院学报，2001，22(6):5-7.

［7］Wu Q G，Hu J Y，Wang Z W.Research progress on the ginsenoside Rg3 in prevention and treatment of tumor and its effective mechanism［J］.Guiding Journal of TCM，2005，11(8):87-89.

［8］Liu T G，Huang Y，Cui D D，et al.Inhibitory effect of ginsenoside Rg3 combined with gemcitabine on angiogenesis and growth of lung cancer in mice［J］.BMC Cancer，2009，9(1):250-260.

［9］Kim J H，Cho S Y，Lee J H，et al.Neuroprotective effects of ginsenoside Rg3 against homocysteine-induced excitotoxicity in rat hippocampus［J］.Brain Res，2007，1136(1):190-199.

［10］Kitagawa I，Yoshikawa M，Yoshigara M，et al.Chemical studies on crude drug precession.I.on the constitution of Ginseng Radix Rubra(1)［J］.Yakugaku Zasshi，1983，103:612-622.

［11］Shin Y W，Bae E A，Kim D H.Inhibitory effect of ginsenoside Rg5 and its metabolite ginsenoside Rh3 in an oxazoloneinduced mouse chronic dermatitis model［J］.Arch Pharm Res，2006，29(8):685-690.

［12］Park I H，Piao L Z，Kwon S W，et al.Cytotoxic dammarane glycosides from processed ginseng［J］.Chem Pharm Bull，2002，50(4):538-540.

［13］Yoo H H，Park J H.Cyclooxygenase inhibitory activity of ginsenoside from heat-processed ginseng［J］.Food Chem，2012，133(3):998-1000.

［14］Kim T W，Joh E H，Kim B，et al.Ginsenoside Rg5 ameliorates lung inflammation in mice by inhibiting the binding of LPS to toll-like receptor-4 on macrophages［J］.Int Immunopharmacol，2012，12(1):110-116.

［15］张 晶，王世荣，陈全成，等.人参皂苷Rg3(R)，Rg3(S)，Rg5/Rk1对乙醇致小鼠记忆阻碍改善作用的影响［J］.吉林农业大学学报，2006，28(3):283-284.

［16］田 桐，宋建国，赵 慕，等.人参皂苷Rg3与Rg5的分离及Rg3异构体的拆分［J］.大连工业大学学报，2011，30(2):109-112.

［17］杨 凌，何克江，杨 义.一种人参二醇型皂甙酸水解制备人参皂甙Rk1和Rg5的方法:中国，CN1463980A［P］.2003-12-31.

［18］Kwon S W，Han S B，Park I H，et al.Liquid chromatographic determination of less polar ginsenosides in processed ginseng［J］.J Chromatogr A，2001，921(2):335-339.

［19］Park H I，Han S B，Kim J M，et al.Four new acetylated ginsenosides from processed ginseng(Sun Ginseng)［J］.Arch Pharm Res，2002，25(6):837-841.