雷公藤多苷对变应性接触性皮炎患者趋化因子IP-10、Eotaxin mRNA表达的影响

邢艳玲，张玉环，廉信

（1.天津市津南区咸水沽医院，天津300350；2.天津市中医药研究院，天津300120；3.山东省桓台县人民医院，桓台250100）

变应性接触性皮炎（allergic contact dermatitis，ACD）是一种由T细胞介导的IV型变态反应，其发病机制相当复杂。近年来的研究表明，ACD属于Th1型疾病，趋化因子及其受体在ACD中具有重要作用[1]。雷公藤多苷属于非甾体类免疫抑制类药物，具有显著的抗炎、免疫抑制等作用，能够调整和改善机体的免疫功能，对细胞免疫和体液免疫均有较强的抑制作用[2]，在临床工作中应用雷公藤多苷治疗ACD效果确切，但其具体机制尚未完全明确。γ干扰素诱导蛋白10（interferon-gamma-inducible protein-10，IP-10）、 嗜 酸 性 粒 细 胞 趋 化 因 子（Eosinophil chemoattractant chemokine,Eotaxin）都属于趋化性细胞因子，IP-10主要表达于Thl型细胞，Eotaxin主要表达于Th2型细胞。其与相应受体结合后主要参与效应T细胞的产生、迁移以及活化，来诱导Thl或Th2细胞免疫。本实验通过观察雷公藤多苷对ACD患者PBMC中趋化因子IP-10、Eotaxin mRNA表达的影响，进一步探讨雷公藤多苷治疗ACD的免疫机制，为临床治疗ACD提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象 30例ACD患者来自2010年3月—2012年10月天津市咸水沽医院皮肤科门诊，其中男11例，女19例，年龄范围18～72岁，平均年龄（38.47±15.61）岁。

1.1.2 主要仪器及药物 电泳仪购于美国Amersham公司；实时RT-PCR检测试剂盒购自TaKaRa公司，PCR扩增仪RG-3000购自澳大利亚Corbett公司；凝胶成像系统（英国UVItec公司）；DEPC液、TRIzol购于Sigma公司；雷公藤多苷，称10 mg雷公藤多苷溶于1 mL二甲基亚砜（DMSO），加入9 mL的RPMI-1640培养液，然后取配好的上述液体0.5 mL，加入到9.5 mL的RPMI-1640培养液中，其浓度为50 mg/L，滤菌分装。

1.2 试验方法

1.2.1 外周血淋巴细胞的分离 取ACD患者外周血5 mL，肝素抗凝，加入等量的Hanks液混匀，移液管吸取稀释血液加于淋巴细胞分离液上，保持淋巴细胞分层液与血样品之间的界限清晰，2000 r/min离心20 min后，液体分为4层，吸取第二层白膜状的单个核细胞层液体，加入5倍量的Hanks液洗涤1次，1000 r/min离心10 min，离心后将沉淀的细胞用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养液配成单细胞悬液。

1.2.2 PBMC抑制率的测定 取上述细胞悬液分别加入不同浓度的雷公藤多苷（0，0.25，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0 mg/L），培养48 h后，分别加入5 g/L的MTT 100 μL 培养 4 h 后加入 DMSO 100 μL，震荡 10 min后立即置酶标仪测吸光度A492 nm值，其中抑制率=[1-（实验组 A/对照组 A）]×100%。

1.2.3 外周血淋巴细胞的培养 取1.2.1中单细胞悬液加入24孔培养板，每孔0.5 mL，根据MTT试验结果，分别加入含有不同浓度雷公藤多苷的RPMI-1640 培养液，使其终浓度分别 5.0，1.0，0.5，0 mg/L，以加有单细胞悬液而不含有雷公藤多苷的培养液孔为对照组，培养48 h后进行检测。

1.2.4 细胞总RNA提取 采用细胞总RNA Trizol试剂提取RNA，严格按照试剂说明书进行提取，取少量在紫外分光光度计260 nm和280 nm下确定浓度和纯度，并在1.2%的琼脂糖凝胶中电泳，然后进行凝胶成像分析。

1.2.5 ACD患者外周血 PBMC中 IP-10、Eotaxin mRNA的检测 ①引物设计与合成：引物由大连宝生物工程有限公司设计并合成，GAPDH为内参基因 ：IP-10：5′-GGCCATCAAGAATTTACTGAAAGC A-3′，5′-TCTGTGGGTCCATCCTTGGAA-3′；Eotaxin：5’-CTCTCCGTAGCAACCCTTTG-3′，5′-TATCCTTGGCCAGTTTGGTC-3′；GAPDH：5′-GCACCGTCAAGGCTAGAAC-3′，5′-TGGTGAAGACGCCAGTGG A-3′。②严格按照实时RT-PCR试剂盒所述方法对ACD患者PBMC中IP-10、Eotaxin mRNA的相对表达量进行测定。反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和溶解曲线，再根据一定的阈值取其CT值，2△△CT法测定 IP-10、EotaxinmRNA 的相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 11.5软件进行统计学分析，数据以均数±标准差（）表示，组间比较采用方差分析进行统计，P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 PBMC抑制率的测定 不同浓度的雷公藤多苷对PBMC生长均成不同浓度的抑制，并且呈浓度依赖性。随着雷公藤多苷剂量的增加，对PBMC的生长抑制率显著上升，其半数细胞的抑制剂量（ID50）值约为 10 mg/L。

2.2 雷公藤多苷高、中、低3个浓度组体外培养的ACD患者PBMC中IP-10 mRNA表达明显低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；雷公藤多苷含药血清3个浓度组之间比较，IP-10 mRNA表达差异均无统计学意义（P>0.05）；雷公藤多苷含药血清3个浓度组之间及与对照组比较，体外培养的ACD患者PBMC中Eotaxin mRNA的表达差异均无统计学意义（P>0.05），见表1。雷公藤多苷含药血清可以明显抑制体外培养的ACD患者PBMC中IP-10 mRNA表达，但与浓度高低无明显关系。雷公藤多苷含药血清对体外培养的ACD患者PBMC中Eotaxin mRNA的表达无影响。

2.3 雷公藤多苷与 IP-10 mRNA、Eotaxin mRNA△CT值的相关性分析 不同浓度的雷公藤多苷（0、0.5，1.0，5.0 mg/L）与 IP-10 mRNA △CT 值存在正相关，相关系数r=0.653（P<0.01）,而与 Eotaxin mRNA△CT值无明显相关关系（P>0.05）。

3 讨论

IP-10具有强大的招募中性粒细胞、促进细胞因子分泌及抑制部分肿瘤生长等多种生物学作用。研究表明，在类风湿关节炎中，趋化因子在炎症细胞向滑膜组织迁移及活化过程中发挥了关键作用，IP-10可与表达在T细胞表面的趋化因子受体CXCR3结合促进其活化并向CD4+Th1细胞方向分化，从而促进炎症反应[3]。Kong等[4]曾报道在系统性红斑狼疮患者中IP-10水平升高，IP-10水平与疾病的活动度相关，甚至在抗dsDNA抗体、C3表达较低的时候，IP-10可作为一种监测疾病活动的敏感指标。因此推测认为IP-10可能通过特异性选择作用于表面CXCR3活性的Th1细胞，在炎症触发过程中起重要作用，并且可能参与SLE免疫异常和发病过程。IP-10和Mig在银屑病患者的皮损中表达持续上调[5]，在活动期斑块型银屑病的角质形成细胞和真皮浸润细胞可测到IP-10，有效治疗后IP-10表达减少[6]。免疫动物产生的针对IP-10的自身特异性抗体可抑制白细胞的迁移，改变自身免疫T细胞的体外Th1/Th2平衡，并能通过过继性的转移抑制疾病的发生[7]。这表明IP-10在T细胞的极化和功能发挥中起着不可替代的作用。

表1 雷公藤多苷对ACD患者PBMC IP-10 mRNA表达的影响

哮喘小鼠气道上皮Eotaxin蛋白及肺组织mRNA的表达明显高于正常对照组，哮喘小鼠气道上皮Eotaxin的表达与Eos计数明显正相关，进一步证实了Eotaxin在哮喘气道黏膜炎症中起调控作用[8]。特应性皮炎皮损中嗜酸粒细胞的沉积与Eotaxin和CCR3的mRNA和蛋白表达水平显著相关，且血中嗜酸粒细胞的增加和皮损中Eotaxin的表达相关[9]，特应性皮炎发病中Th2细胞亚群占优势已受到广泛认可。有研究表明，Eotaxin在小鼠ACD模型的炎症皮肤中及TNF-γ和IL-4的诱导下，可以表达大量的Eotaxin mRNA[10]，由此说明Eotaxin在T细胞介导的免疫性疾病的发病中起着重要作用。雷公藤多苷作用于儿童过敏性紫癜时，能抑制CD4+T细胞功能，改善CD8+细胞功能，下调CD4+/CD8+比值而发挥临床效应[11]。而在治疗银屑病时，雷公藤多苷却能使患者外周血中降低的CD3+、CD4+及CD4+/CD8+比值升高并恢复正常[12]，同时，雷公藤可通过上调IL-10，下调 TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-8 等促炎症因子的表达，抑制Th1反应的启动，使免疫状态由Th1向Th2漂移[13]。有研究认为，雷公藤抑制Th1，Th2细胞因子产生的作用无特异性[14]。近年来，也有研究表明，雷公藤可能通过抑制趋化因子及受体的表达而抑制炎症的发生[15]。

在本试验中，雷公藤多苷含药血清高、中、低3个浓度组体外培养的ACD患者PBMC中IP-10 mRNA的表达明显低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；雷公藤多苷含药血清3个浓度组之间比较，IP-10mRNA表达差异均无统计学意义（P>0.05）；雷公藤多苷含药血清3个浓度组之间及与对照组比较，体外培养的ACD患者PBMC中Eotaxin mRNA的表达差异均无统计学意义（P>0.05）。雷公藤多苷含药血清可以明显抑制体外培养的ACD患者PBMC中IP-10 mRNA的表达，但与浓度高低无明显关系。而其对体外培养的ACD患者PBMC中Eotaxin mRNA的表达影响不明显。故推测雷公藤多苷治疗ACD的机制之一可能是通过调节IP-10、Eotaxin等趋化性细胞因子水平，改变细胞因子的表达，促进Th1/Th2平衡来实现的。

[1] Serra HM,Eberhard Y,Martin AP,et al.Secondary lymphoid tissue chemokine（CCL21）is upregulated in allergic contact dermatitis[J].Int Arch Allergy Immunol,2004,133:64-71.

[2]路鸥，史冬梅.雷公藤内酯治疗变应性接触性皮炎的机制研究进展[J].山东医药，2008,48（43）:117-118.

[3] 满斯亮，张丽丽，孙琳，等.趋化因子 CXCL10（IP－10）/CXCR3在类风湿关节炎发病中的作用及应用前景[J].中国老年多器官疾病杂志，2011，10（5）：460－464.

[4]Kong KO，Tan AW，Thong BY，et al.Enhanced expression of interferon-inducible protein-10 correlates with disease activity and clinical manifestations in systemic lupus erythematosus[J].Clin Exp Immunol，2009，156:134-140.

[5] Peitsch MC，Irmler M，French LE，et al.Genomic organisation and expression of mouse deoxyribonuclease I[J].Biochem Biophys Res Commun,1995，207:62-68.

[6] Napirei M，Karsunky H，Zevnik B，et al.Features of systemic lupus erythematosus in Dnasel-deficient mice[J].Nat Genet，2000，25：177-181.

[7] 杨士军，崔建和，薛梅，等.银屑病患者血清IL-8、IP-10的含量及意义[J].放射免疫学杂志，2005，18（3）：168－169.

[8] 盛青，何建猷，周爱莲，等.雷公藤甲素对哮喘小鼠信号转导和转录激活因子6及Eotaxin表达的影响 [J].国际呼吸杂志，2006，26（1）：12－15.

[9] Yawalkar N，Uguccioni M，Seharer J，et al.Enhanced expression of Eotaxin and CCR3 in atopic dermatitis[J].Invest Dermatol，1999,1:43-48.

[10]Vocanson M，Hennino A，Rozieres A，et al.Effector and regulatory mechanisms in allergic contact dermatitis[J].Allergy，2009，64:1699-1714.

[11]白海涛.雷公藤多甙对儿童过敏性紫癜免疫功能的干预作用[J].实用儿科临床杂志,2002,17（4）：335-336.

[12]冯文莉，张荣丽，王丽，等.雷公藤多甙对银屑病患者T淋巴细胞亚群的作用及意义[J].山西医科大学学报，2002，33（5）：453-455.

[13]Tac X，Lipsky PE.The Chinese anti-inflammatory and immune suppressive herbal remedy Tripterygium wilfordii Hook F[J].Rhemn Dis Clin NoAh Am,2000,26:29-50.

[14]林科雄，王长征，钱桂生.雷公藤多甙对哮喘患者Th1,Th2细胞因子产生的影响[J].中国中西医结合杂志，2001，21（1）：22-24.

[15]曹红杨，明辉，魏锦.雷公藤多甙对类风湿关节炎患者表达趋化因子的影响[J].四川中医，2006，24（10）：21-22.