HBD-1、HBD-2和NF-κBp65在红皮病银屑病皮损中的表达

王淑艳，翟宁，周鸿波，耿龙

（中国医科大学附属第一医院，沈阳110001）

红皮病又称剥脱性皮炎，是一种较严重的皮肤疾病，表现为皮肤弥漫性潮红、肿胀、浸润、脱屑，有时可以导致内脏损伤和代谢紊乱，为多种原因引起的一种综合病症，死亡率也较高[1]。引起该病因素很多，包括银屑病、湿疹-皮炎、药物过敏反应、恶性肿瘤及原因不明者，银屑病是最常见的原因。人类防御素 β（human β-defensins,HBD）存在于皮肤和黏膜上皮组织,可分为两种，HBD-1为组成性表达，HBD-2为诱导性表达且受到较多关注，感染和一些炎症细胞因子如白细胞介素（IL）-1α、IL-1β、肿瘤坏死因子（TNF）-α、干扰素（IFN）-γ等能明显诱导或增强HBD-2表达水平[2]。核转录因子κBp（Nuclear-factor-κBp，NF-κBp） 是一种作用广泛的转录因子，调控众多细胞因子和炎症介质的基因表达，参与细胞内信号传递，调节免疫反应，从而影响组织细胞的生理、病理反应。本研究拟通过探讨HBD-1、HBD-2和NF-κBp65在银屑病红皮病皮损中的表达情况，分析 HBD-1、HBD-2、NF-κBp65 在银屑病红皮病的发生和发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 对象来源 病例组：2012年1月—2013年3月30例红皮病继发于银屑病者。女13例，男17例。年龄17～80岁，平均（56.00±16.59）岁。均来自中国医科大学附属第一医院皮肤科，经临床及组织病理证实的银屑病红皮病患者。正常对照皮肤10例，女6例，男 4 例，年龄 20～76 岁，平均（50.66±18.46）岁，来源于中国医科大学附属第一医院整形外科非皮肤疾病患者。

1.2 试剂和研究方法

1.2.1 主要试剂 兔抗人HBD-1，2多克隆抗体以及NF-κBp65多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司），羊抗兔二抗（河北博海生物工程有限公司），柠檬酸缓冲液，DAB显色剂等。

1.2.2 免疫组织化学方法检测 染色步骤严格按照试剂说明书进行。切片标本经二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水后加50 μL山羊血清，室温孵育20 min。去血清，分别滴加 50 μL的 1∶200稀释兔抗人RBD-1、RBD-2和 NF-κBp65多克隆抗体，4℃过夜。滴加50 μL生物素标记的羊抗兔二抗，室温孵育20 min，滴加50 μL辣根酶标记链酶卵白素工作液，室温孵育20 min。滴加100 μL新鲜配制的DAB，显微镜下观察1～2 min至合适显色。自来水冲洗，苏木精复染，盐酸乙醇分化，自来水冲洗返蓝。梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.2.3 免疫组化结果判断标准 以细胞浆中出现黄色至棕黄色颗粒，着色高于背景底色为阳性，胞浆不着色或呈浅黄色判断为阴性。以染色强度和密度作半定量记录（0～Ⅲ级），0级：阴性或染色弱，整个切片反应率＜10%；Ⅰ级：轻度阳性（+），染色弱或部分染色，整个切片反应率10%～20%；Ⅱ级：中度阳性（++），染色清晰，整个切片反应率20%～50%；Ⅲ级：强染色（+++），染色清晰，整个切片反应率＞50%。

1.3 统计学方法 组间比较进行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBD-1蛋白阳性表达 表现为细胞浆着色，也有细胞核内着色，主要表达于基底层细胞。HBD-1在正常皮肤组织和红皮病皮损组织中表达差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。证明HBD-1为固有表达，与疾病的发生、发展程度无关。

表1 正常皮肤和红皮病皮损组织HBD-1的表达 例

2.2 HBD-2蛋白阳性表达 主要位于基底层细胞膜和细胞浆内，红皮病皮损中HBD-2表达的阳性率为96.67%,正常皮肤表达阳性率20%，2组比较差异有统计学意义（χ2=42.65，P<0.01）。见图 1、2，表 2。

图1 正常皮肤组织HBD-2表达（H E染色×200）

图2 红皮病皮损组织HBD-2表达（H E染色×200）

表2 正常皮肤和红皮病皮损组织HBD-2的表达 例

2.3 NF-κBp65表达 正常皮肤组织中，NF-κBp65为阴性表达或部分在细胞浆中表达，表达率20%。在红皮病皮损中，NF-κBp65主要表达于基底层附近区域的细胞浆中，表达的阳性率为93.33%，2组比较差异有统计学意义（χ2=39.44，P<0.01）。见图 3、4，表 3。

表3 正常皮肤和红皮病皮损组织NF-κB p65的表达 例

图3 正常皮肤组织NF-κB p65表达（H E染色×200）

图4 红皮病皮损组织NF-κB p65表达（H E染色×200）

3 讨论

β-防御素不仅具有直接杀伤病原体的作用，还具有化学趋化作用及与其他蛋白酶（如溶菌酶）的协同作用，抗菌活性和对白细胞趋化活性的发挥与组织中所含β-防御素浓度有关[3]。在感染局部，β-防御素被大量诱导表达和释放，经过扩散而浓度降低后，则丧失杀菌活性，发挥趋化活性，募集白细胞到达组织局部以清除入侵病原体[4]。

本研究表明HBD-1在正常组和红皮病组织中均有表达，2 组间差异无统计学意义（P＞0.05），证实HBD-1为组成性表达，不受炎症状态的诱导，与多数学者研究结果一致。提示HBD-1主要是维持正常皮肤微生态的稳定，在正常皮肤组织的先天性免疫中起着重要的作用。HBD-2最早是在银屑病患者病灶中发现并分离成功的，因病灶中防御素表达高，故银屑病病灶极少发生感染[5]。HBD-2不仅可直接杀菌而抵御入侵的病原微生物，还在介导获得性免疫、调节炎症反应和创伤修复中起重要作用[6]。研究表明红皮病皮损表皮HBD-2表达部位不仅为基底层，表皮全层均可见棕黄色染色，表达水平显著增强，除与抗微生物活性相关以外，还可能与免疫调节有关。提示HBD-2可能介导了炎症反应，参与了红皮病的发病过程。通常上皮细胞不表达或微量表达HBD-2，但当感染时则大量表达[7]。

有研究表明银屑病皮损处有大量活化的NF-κBp65。Lizzul等[8]研究表明正常皮肤中不存在活化形式的NF-κBp65，银屑病患者非皮损区有少量NF-κBp65，皮损区则存在大量活化形式的NF-κBp65。本研究显示银屑病红皮病皮损区NF-κBp65在表皮上层显著表达，胞核见较深棕褐色颗粒表达，提示NF-κBp65异常表达可能与红皮病的发生、发展过程密切相关。Tsutsumi等[9]用LPS刺激鼠巨噬细胞证实了被激活的NF-κBp65参与了HBD-2的表达。

本研究通过检测HBD-1、HBD-2和NF-κBp65在红皮病皮损及正常皮肤组织中表达情况，探讨三者在红皮病中表达的关系。推测炎症反应及炎症细胞因子可激活NF-κBp65信号通路实现对靶细胞的影响，并通过诱导HBD-2发挥作用，参与银屑病红皮病的发病。

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