黄芪多糖对2型糖尿病大鼠HPA轴及海马糖皮质激素受体水平的调节作用*

★ 丁曦 姚定国

(浙江中医药大学第一附属医院 杭州 310009)

黄芪多糖对2型糖尿病大鼠HPA轴及海马糖皮质激素受体水平的调节作用*

★ 丁曦 姚定国

(浙江中医药大学第一附属医院 杭州 310009)

目的：观察黄芪多糖(APS)对2型糖尿病大鼠HPA轴及海马组织中糖皮质激素受体水平的调节作用。方法：30只SD大鼠随机分为正常对照组、DM模型组、APS干预组组，采用小剂量链脲佐菌素加高脂饮食饲养的方法建立2型糖尿病肥胖大鼠模型。成模4周后，断头处死所有大鼠，检测各组大鼠血CRH、ACTH、CorT的含量，以及海马组织中糖皮质激素受体(GR)mRNA的表达。结果：DM模型组血ACTH、CorT含量较正常组显著升高，与模型组大鼠相比，APS干预组大鼠血ACTH、CorT含量显著降低(P<0.05)；DM模型组海马GRmRNA含量较正常组极显著降低，与模型组大鼠相比，APS干预组大鼠海马GR mRNA含量明显上调(P<0.01)。结论：APS保护高糖环境下的海马组织，改善HPA轴功能，对糖尿病以及合并症起到治疗作用。

黄芪多糖；2型糖尿病；HPA轴；海马GR mRNA

2型糖尿病主要由胰岛素抵抗，胰岛β细胞损伤引起。既往研究也大都聚焦于此，对于升糖激素以及HPA轴的研究较少。新近研究发现，2型糖尿病患者体内存在慢性氧化应激，这种慢性应激可损伤海马，引起海马退行性变，海马对HPA轴抑制功能减弱，血浆糖皮质激素水平升高。本研究选用SD大鼠制作模拟2型糖尿病模型，采用黄芪多糖(Astragalus poly saccharides，APS)进行干预，观察模拟2型糖尿病大鼠的海马组织中糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor，GR)mRNA水平，以及HPA轴(CRH、ACTH、CorT)的功能变化，探讨神经内分泌免疫网络与2型糖尿病的联系。

1 材料与方法

1.1 造模及成模标准

选择SD成年雄性健康大鼠(8周龄，约250g)30只，分正常对照组10只，造模组20只大鼠(APS干预组10只，以及DM对照组10只)。对照组大鼠，普通饲料喂养；造模组高脂高糖饲料喂养4周后，腹腔注射STZ 25mg/kg第1次，4周后腹腔注射STZ 40mg/kg第2次，自由摄食与饮水诱导胰岛素抵抗。出现胰岛素抵抗且空腹血糖≥13.8mmol/L者为成模标准。

1.2 分组及处理

以水煮醇沉法提取黄芪多糖(APS)，由浙江省中医院制剂中心制备。各组动物自确定造模成功后第2天开始灌胃，1次/d：APS干预组予以70%纯度的APS水溶液，按1.0g/kg/d灌胃；正常对照组和DM对照组灌服等量生理盐水。

1.3 主要检测指标

成模4周后，每组断头处死所有大鼠，检测指标，包括：各组大鼠血CRH、ACTH、CorT含量的测定，以及海马糖皮质激素受体(GR)mRNA表达的测定。

1.3.1 血CRH、ACTH、CorT含量的测定

CRH、ACTH采血管中预先加入0.3mmol/L己二胺四乙酸二钠溶液(每毫升全血20μL)和抑肽酶(每毫升全血500U)，预冷准确采集全血4mL，轻缓混匀，迅速在低温(4℃)下离心，取血浆低温保存。CorT采血管中预先不加抗凝剂，预冷准确采集全血1mL，低温(4℃)离心，取血清低温保存。检测步骤严格按照CRH、ACTH、CORT试剂盒说明书操作。

1.3.2 海马GR mRNA表达的测定

各组大鼠断头取脑，分离脑组织各部，液氮速冻后转移至-80℃冰箱中，备逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)使用。TRIzol提取海马总RNA，用分光光度计测定RNA浓度。

GR mRNA引物上游：5'-CCTCCCATTCTAACCATCCTCA-3'，下游：5'-GCCTCCCTCTGCTAACCTGTG-3'。内参β-actin引物：上游5'-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3'，下游5'-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3'。92℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，72℃后延伸5min，扩增30循环。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，EB显色，DH-202型数码凝胶成像系统成像，CMIAS 图像分析系统计算积分吸光度值(A值)。GR mRNA水平以PCR产物的A值与β-actin PCR产物A值之比表示。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠的血CRH、ACTH、CorT含量比较(见表1)

与正常对照组相比，DM模型组大鼠的血ACTH、CorT含量均显著增高(P<0.05)；与DM模型组比较，APS干预组大鼠的2种激素含量均明显降低(P<0.05)。

表1 各组大鼠血CRH、ACTH及CorT比较

2.2 各组大鼠海马GR mRNA表达(见表2)

与正常对照组相比，DM模型组大鼠海马GR mRNA含量极显著增高(P<0.01)；与DM模型组比较，APS干预组大鼠海马GR mRNA含量极明显降低(P<0.01)。

表2 各组大鼠海马GR mRNA表达比较

3 讨论

糖尿病因其严重的慢性并发症而成为全球面临的日益严峻的问题。近年来，2型糖尿病与神经内分泌免疫网络的关系已引起重视。国内外研究发现，部分2型糖尿病患者下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)的基础活性呈不同程度的增高状态[1]，昼夜节律也发生紊乱，表现为ACTH、皮质醇水平的增高，从而加重组织胰岛素的抵抗。因此，如何抑制HPA轴的功能亢进，是研究糖尿病以及合并症发病机制及治疗的一条探索途径。

HPA轴激活的中枢控制复杂，海马作为负反馈调节的高位中枢，又是应激反应的敏感区，以糖皮质激素(GC)为信息因子参与抑制性调节，糖皮质激素受体(GR) mRNA水平的高低显示海马的功能状态。持续性的高糖刺激，导致氧化应激产物蓄积，表现为氧化物O2-·产量增加，抗氧化物SOD、GSH-PX等活性下降，引起海马神经元损伤和功能障碍。本课题证实，DM模型组大鼠海马组织中的GR水平明显降低[2]。海马对于HPA轴的抑制功能减退，皮质醇分泌亢进；过多的皮质醇反过来直接损伤海马，促进兴奋性氨基酸释放，造成海马乃至全脑兴奋性毒性，加重海马损伤。

黄芪是常用的补气药，气味温甘，对于“久病伤气”的患者，尤为适宜。长期的高糖刺激，产生胰岛素抵抗，导致体内葡萄糖摄取和利用障碍，患者常有疲劳感，符合中医的“气虚”证，因此黄芪也是常用的降糖中药之一。黄芪多糖(APS)是黄芪中的主要生物活性成分之一，具有免疫调节、抗肿瘤、促进骨髓造血干细胞增殖、抗氧化应激等药理作用[3-5]。APS在治疗糖尿病及其并发症方面也有显著疗效，其具体的降糖机制一直是研究的热点。本课题结果显示，APS保护高糖环境下的海马组织，改善HPA轴功能，降低患者体内ACTH及CorT水平，从而对糖尿病以及合并症起到治疗作用。

[1]章汝霜.下丘脑-垂体-肾上腺轴与糖尿病[J].国际病理科学与临床杂志，2006，25(6)：550-551.

[2]Chan O，Inouye K，Varanic M，et al.Hyperactivation of the hypothalamo-pituitary-adrenocortical axis in streptozotocin-diabetes is associated with reduced stress responsiveness and decreased pituitary and adrenal sensitivity[J].Endocrinology，2003，143：1 761-1 768.

[3]刘端勇，赵海梅，周枫，等.黄芪多糖调节小鼠小肠黏膜淋巴细胞因子的表达[J].中国中医基础医学杂志，2009，14(9)：692.

[4]Wang T，Sun Y，Jin L，et al.Enhancement of non-specific immune response in sea cucumber by Astragalus membranaceus and its polysaccharides[J].Fish Shellfish Immunol，2010，27(6)：757.

[5]曾广仙，刘俊英，熊金蓉，等.黄芪多糖调节创伤应激小鼠免疫功能的研究[J].中华微生物学和免疫学杂志，2005，24(12)：942.

RegulatingEffectofAPSontheExpressionLevelsofHPAAxisandGRmRNAintheHippocampusofType2DiabeticRats

DINGXi，YAODing-guo

TheFirstAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicineUniversity,Hangzhou310000,China

Objective：To observe the regulating effect of APS on the expression levels of HPA axis and GR mRNA in the hippocampus of type 2 diabetic rats. Methods: To establish type 2 diabetic rats in obsess by injecting of low-dose STZ and fedding with high glucose and high-fat diet，after that the rats were randomly divided into 3 groups：normal group，model group，APS treatment group. After given different treatments for 4 weeks the rats were executed to test the expression levels of CRH、ACTH、CorT in plasma of rats and GR mRNA in the hippocampus. Results: Compared with model groups，the expression levels of ACTH、CORT in plasma of APS treatment group are signifi cantly lower(P<0.05)；the expression levels of GR mRNA in the hippocampus of APS treatment group are upgrade(P<0.01). Conclusion: APS can protect hippocampus，improve the function of HPA axis，and delay the occurrence of Diabetes and its complications.

APS；Type 2 Diabetes Mellitus；HPA Axis；GR mRNA

浙江中医药大学校级科研项目(项目编号：2012ZY04)。

R 285.5

A

2013-05-28)