Box-Behnken设计优化回流提取山楂降脂有效成分的工艺研究

★ 侯莉伟 杨明 熊永爱 杨凤梅 邹文铨

(1.成都中医药大学药学院 成都 611137；2.江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室 南昌 330004；3.四川大学分析测试中心 成都 610054)

Box-Behnken设计优化回流提取山楂降脂有效成分的工艺研究

★ 侯莉伟1*杨明1,2**熊永爱1杨凤梅1邹文铨3

(1.成都中医药大学药学院 成都 611137；2.江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室 南昌 330004；3.四川大学分析测试中心 成都 610054)

目的：优化回流提取山楂降脂有效成分的工艺。方法：在单因素实验的基础上，采用回流提取法，选取乙醇体积分数、溶媒用量、提取时间为考察因素，以熊果酸、金丝桃苷得率及干膏率的加权平均值为指标，通过Box-Behnken响应面设计优化提取工艺。结果：最佳提取工艺为：乙醇体积分数70%、溶媒用量12倍、提取时间100min、提取2次。在此条件下，熊果酸、金丝桃苷得率分别为0.548%、0.093%，干膏率33.92%，与模型预测值较接近。结论：优化的提取工艺稳定可行，可为山楂降脂成分的进一步研究提供参考。

山楂；Box-Behnken设计；熊果酸得率；金丝桃苷得率；干膏率；加权平均值

山楂为蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge.var.majorN.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果实。性味酸甘，具有消食健胃，行气散瘀，化浊降脂的功效。用于治疗肉食积滞，瘀血经闭，高脂血症等，[1]被列入卫生部公布的《关于进一步规范保健食品原料管理的通知》药食两用的名单之中。主要含有黄酮类和三萜酸类等成分。金丝桃苷、熊果酸是山楂黄酮和三萜类物质的主要成分，是山楂降血脂的活性成分。[2-4]本实验采用回流提取法，以熊果酸、金丝桃苷得率和干膏率的加权平均值(R1)为考察指标，通过Box-Behnken实验设计对回流提取山楂降脂有效成分的工艺进行优化，从而确定最佳提取工艺参数。为山楂降脂药效和制剂的研究提供依据和参考。

1 仪器与材料

N2000型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，UV-1700型紫外分光光度计(日本岛津公司)，DZF-1B型真空干燥箱(上海跃进医疗器械厂)，BSA224S型电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)，DZKW-4型电热恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)，SZ-93型自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)，KQ-400DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

山楂饮片(四川科伦天然药业有限公司，批号121009，经成都中医药大学药学院卢先明教授鉴定为蔷薇科植物山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果实)；熊果酸对照品(成都瑞芬思生物科技有限公司，批号X-006-130124)；金丝桃苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号111521-201205)；乙腈(色谱纯，Fisher公司)；水(双蒸水，自制)；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 称取山楂粗粉5.00g于100mL圆底烧瓶中，加无水乙醇30mL，回流提取2次，每次1h，合并2次滤液，于50mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，即得。

2.2 熊果酸的含量测定

2.2.1 对照品溶液的配制 精密称定熊果酸对照品12.2mg于25mL容量瓶中，加无水乙醇适量，超声处理使溶解完全，加无水乙醇至刻度，摇匀，得0.488mg/mL的熊果酸对照品溶液。

2.2.2 色谱条件 色谱柱为Agilent TC-C18(2)柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为乙腈-0.3%磷酸水(77∶23)，流速1 mL/min，柱温25℃，检测波长212nm，进样量10μL。

2.2.3 专属性 分别按照“2.2.2”项下色谱条件进行空白、对照品和供试品溶剂的测定，结果表明该方法专属性良好，各成分和溶剂间无干扰。

2.2.4 标准曲线的绘制 准确吸取熊果酸对照品1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5mL，分别于10mL容量瓶中，无水乙醇定容至刻度，摇匀。按照“2.2.2”项下进行测定，以峰面积为纵坐标(Y)，浓度为横坐标(X)绘制标准曲线，得回归方程Y=3.3×106X+76673，r=0.9996，说明熊果酸在0.0488-0.1708mg/mL范围内与峰面积有良好的线性关系。

2.3 金丝桃苷的含量测定

2.3.1 对照品溶液的配制 精密称定金丝桃苷对照品10.2mg于50mL容量瓶中，加甲醇适量，超声处理使溶解完全，加甲醇至刻度，摇匀，得0.204mg/mL的金丝桃苷对照品溶液。

2.3.2 显色试剂的配置 准确称取A1Cl31.34g，于100mL容量瓶中，加甲醇至刻度，配制成0.1mol/L的溶液。准确称取CH3COONa·3H2O 2.72g，于100mL容量瓶中，加蒸馏水溶解至刻度，配制成0.2mol/L的溶液。精密吸取1.15mL冰醋酸，于100mL容量瓶中，蒸馏水稀释至刻度，配制成0.2mol/L的溶液[5]。

2.3.3 标准曲线的绘制 准确吸取金丝桃苷对照品1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL，分别于25mL容量瓶中，加1mL pH为5.2的醋酸-醋酸钠缓冲溶液和2mL 0.1mol/L A1Cl3溶液，甲醇定容到刻度，摇匀，40℃水浴显色10min。[5]以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度计(附录ⅤA)，在409nm处测吸光度。以吸光度(Y)为纵坐标，浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=12.675X-0.0133，r=0.9994，说明金丝桃苷在0.00816-0.04896mg/mL范围内与吸光度有良好的线性关系。

2.4 干膏率的测定 量取提取液50mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，挥干溶剂，于105℃烘箱干燥3h，干燥器中冷却30min，迅速精密称定重量，即干膏重。

2.5 数据处理 以熊果酸得率(Y1)、金丝桃苷得率(Y2)和干膏率(Y3)的加权平均值(R1)为综合评价指标。R1=(x1×f1/x1max+x2×f2/x2max+x3×f3/x3min)×100，其中x1、x2、x3分别表示熊果酸、金丝桃苷得率和干膏率，鉴于金丝桃苷和熊果酸均为山楂降脂的活性成分，故二者取相同的权重系数，均设为0.4。在有效成分明显的前提下，干膏率越高则纯度越低，故设其权重系数为-0.2。[6-7]

2.6 单因素实验结果

2.6.1 乙醇体积分数 称取山楂粗粉6份，每份5.00g，分别加入8倍量体积分数为40%，50%，60%，70%，80%，90%的乙醇，回流提取2次，每次1h，合并2次滤液，按“2.2.2、2.3.3、2.4”项下测定熊果酸、金丝桃苷得率和干膏率并计算R1值。结果分别为12.68，24.79，43.65，54.75，32.97，28.29，表明70%乙醇提取R1达最大值。

2.6.2 溶媒倍数 称取山楂粗粉6份，每份5.00g，分别加入6，8，10，12，14，16倍量70%的乙醇，回流提取2次，每次1h，合并2次滤液，按“2.2.2、2.3.3、2.4”项下测定熊果酸、金丝桃苷得率和干膏率并计算R1值。结果分别为15.09，27.10，46.56，59.65，55.20，55.47，表明12倍量溶媒提取R1达最大值。

2.6.3 提取时间 称取山楂粗粉6份，每份5.00g，分别加入12倍量70%的乙醇，回流提取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0h，提取2次，合并2次滤液，按“2.2.2、2.3.3、2.4”项下测定熊果酸、金丝桃苷得率和干膏率并计算R1值。结果分别为40.56，52.53，57.01，55.03，38.64，34.14，表明提取1.5hR1达最大值。

2.6.4 提取次数 称取山楂粗粉6份，每份5.00g，分别加入12倍量70%的乙醇，回流提取1，2，3，4次，每次1.5h，合并滤液，按“2.2.2、2.3.3、2.4”项下测定熊果酸、金丝桃苷得率和干膏率并计算R1值。结果分别为13.51，35.72，41.13，44.68，结合生产成本考虑，选择提取2次。

2.7 Box-Behnken设计

综合相关文献报道及单因素实验，影响提取工艺的主要因素有乙醇体积分数(A)、溶媒倍数(B)、提取时间(C)。故以这3个因素为主要考察因素，提取2次，以R1为综合评价指标进行实验设计。因素水平见表1。

表1 Box-Behnken实验因素水平表

2.8 模型拟合

按照Box-Behnken实验设计要求，应用Design-Expert软件以R1对各因素进行二次多项式方程拟合。Box-Behnken设计及结果见表2，回归方程方差分析见表3。

由表3方差分析可见，A2、C2为显著性影响因素，C为极显著性影响因素。在总的作用因素中，平方项对R1的影响最为显著，其次为一次项，交互项的影响较小。模型的显著性水平P=0.0177<0.05，表明该模型方程与实际实验拟合良好，实验误差较小，能充分反映实际情况。模拟方程为R1=+56.98800+4.59750A+3.24250B+9.09250C+4.00750AB-1.46250AC-6.60250BC-10.15525A2-5.01025B2-9.98025C2。

表2 Box-Behnken设计及结果

表3 回归模型方差分析结果

2.9 效应面优化预测及验证结果

2.9.1 优化工艺预测 根据二次多项式模型方程拟合结果，做出R1的效应曲面及等高线图，见图1。以R1对最佳提取工艺进行预测，结果为乙醇体积分数72.3%，溶媒用量12.32倍，提取时间1.69h，R1=59.53。

2.9.2 验证实验 考虑生产实际情况和操作可行性，对各因素进行取整数，则最佳提取工艺确定为：乙醇体积分数70%、溶媒用量12倍、提取时间100min、提取2次。称取山楂最粗粉3份，每份150g，按照最佳提取工艺进行验证实验，结果为Y1=0.548%(RSD1.52%)，Y2=0.093%(RSD2.84%)，Y3=33.92%(RSD2.36%)。与模型预测值Y1=0.607%，Y2=0.098%，Y3=32.65%较接近，说明优选的工艺参数较可靠。

图1 乙醇浓度(A)、液固比(B)和提取时间(C)间的效应面及等高线图

3 讨论

Box-Behnken实验设计能够将复杂的未知函数关系在小区域内用简单的二次多项式模型进行拟合，计算比较简便，是降低开发成本、优化工艺条件、提高产品质量，解决生产过程中实际问题的一种有效方法。与只能对一个个独立实验点进行分析的正交试验相比，其优势是充分考虑了实验的随机误差，在考察最优实验条件过程中，可以连续对实验的各个水平进行分析。并能绘制出效应曲面与等高线图，直观地看到因素间的变化规律。[8]实验结果表明，加热回流提取山楂降脂有效成分最优工艺为：乙醇体积分数70%、溶媒用量12倍、提取时间100min、提取2次。

高脂血症(HLP)是当今社会的常见病、多发病，是人体内脂质代谢失常、血浆内脂质浓度超过正常高限的一种疾病，与引起人类死亡的首要疾病，心脑血管疾病有着十分密切的关系。是动脉粥样硬化、脂肪肝、冠心病、糖尿病、肥胖症等的伴发症及诱发因素。[9]现代药理研究表明，山楂具有降血脂、降血压、降血糖、活血化瘀、强心、抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤、抑菌消炎等多种功效。[10]为消油腻肉食积滞的要药，既可直接入药，又可水煎代茶饮。张曼[11]通过研究山楂对HLP小鼠血脂及脂蛋白酯酶和肝酯酶的影响表明，山楂可通过提高脂蛋白脂酶、肝脂酶的活性，降低胆固醇、甘油三酯含量，且具有升高高密度脂蛋白胆固醇含量和降脂酶活性的作用。林薇等[12]对山楂降脂汤(组方为生炒山楂、荷叶、柴胡、莱菔子、生黄芪)研究表明，山楂降脂汤能显著调节机体血脂水平，具有有效预防HLP和保护血管内皮细胞的功能。

山楂为天然植物，能够满足现代人追求绿色自然的要求。山楂单味和复方制剂在降血脂方面的研究和开发具有较好的现实意义和可预测的市场前景。本研究通过以熊果酸和金丝桃苷为指标成分，确定回流提取山楂降脂有效成分的工艺参数。旨在为山楂降脂疗效的研究及相关降脂中成药的开发提供参考依据。

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征稿启事

《江西中医药》所设的重点栏目有《明医心鉴》、《滕王阁医话》等。《明医心鉴》以介绍名老中医经验和中医临证心得为主，重点刊载中医关于疑难病的诊疗经验，要求观点、方法新，经验独到。《滕王阁医话》主要反映中医教学、科研、临床的一得之见，要求以小见大，有感而文，语言生动流畅，可读性强，富于知识性、趣味性。

OptimizationofRefluxExtractionofLipid-loweringComponentsinCrataegusPinnatifidaBge.byBox-BehnkenDesign

HOULi-wei1*,YANGMing1,2**,XiongYong-ai1,YANGFeng-mei1,ZOUWen-quan3

1.CollegeofPharmacy，ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine(TCM),Chengdu611137;2.KeyLaboratoryofModernPreparationofTCM，MinistryofEducation,JiangxiUniversityofTCM,Nanchang330004;3.AnalyticalandTestingCenterofSichuanUniversity,Chengdu610054

Objective:To optimize reflux extraction of lipid-lowering components from Crataegus pinnatifida Bge. Method:Based on the single factor experiments,reflux extraction method was used,with weighted means of ursolic acid yield,hyperoside yield and rate of dry extract as index.The factors such as ethanol volume fraction ,solvent dosage,extraction time were optimized by Box-Behnken response surface methodology. Result:The ursolic acid yield,hyperoside yield and rate of dry extract was 0.548%,0.093%,33.92% respectively,using ethanol volume fraction 70%,liquid-material ratio of 12:1 and extracted for 102min,twice,which was regarded as the optimum extraction process.These datas were close to model predictor. Conclusion:The optimized extraction technology was stable and practicable．It could provide the reference for further studying lipid-lowering components of Crataegus pinnatifida Bge.

Crataegus Pinnatifida Bge. ; Box-Behnken Design;Ursolic acid Yield;Hyperoside Yield;Rate of Dry Extract ; Weighted Means

侯莉伟，硕士研究生，从事中药药剂学研究，Tel:18782085707，E-mail:514296193@qq.com

**通讯作者：杨明，博士，教授，博士研究生导师，从事中药新制剂研究，E-mail:yangming16@126.com

R284.3

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2013-07-31)