盐酸阿扑吗啡鼻喷剂微生物限度检查方法的验证

王连兰 郭小红

1 供试品、培养基、器材及菌种

1.1 供试品 盐酸阿扑吗啡鼻喷剂批号:110417由浙江济民制药股份有限公司提供(注:验证试验采用一批供试品三次独立的平行试验)

1.2 培养基 脂培养基(批号101130);玫瑰红钠琼脂培养基(批号110808);改良马丁培养基(批号1105242);改良马丁琼脂培养基(批号100622);胆盐乳糖培养基(批号100031);营养肉汤培养基(批号100628);甘露醇氯化钠培养基(批号100825);硫乙醇酸盐流体培养基(批号110311);4-甲基伞形酮葡糖苷酸(MUG)培养基(批号:091029);麦康凯琼脂培养基(批号100125);溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基(批号:101005);稀释液(冲洗液):pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(批号1105312);以上培养基、稀释液均由北京三药科技开发公司生产。

1.3 器材 HTY-2000A集菌仪;PY-330型号一次性使用集菌培养器(批号20110924);可拆卸式集菌仪培养器以上器材均由杭州泰林医疗器械有限公司提供。

1.4 验证用微生物及其菌号 枯草芽胞杆菌CMCC(B)63501，金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠埃希菌CMCC(B)44102，白色念珠菌CMCC(F)98001，黑曲霉CMCC(F)98003，铜绿假单胞菌CMCC(B)10104

2 菌液制备［1］

2.1 取经30～35℃培养18～24 h，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌的肉汤培养物1 ml加9 ml盐水(0.9%无菌氯化钠溶液)，10倍稀释至10-7，细菌数约为10～100CFU/ml，做活菌计数备用。

2.2 经20～25℃培养24～48 h的白色念珠菌改良马丁液体培养物1 ml加9 ml盐水(0.9%无菌氯化钠溶液)，10倍稀释至10-7，细菌数约为10～100CFU/ml，做活菌计数备用。

2.3 取经20～25℃培养5～7 d的黑曲霉改良马丁琼脂培养物，加3～5 ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱，再用无菌毛细吸管吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将菌悬液稀释至每1 ml中含10～100CFU的孢子悬液，做活菌计数备用。采用中国药典2010版提供的方法制备菌液，除黑曲霉菌液取10-5外，其余5种均取10-7的菌液。

3 方法及结果

中国药典有关微生物限度检查法方法验证试验［2］。

3.1 菌落计数(常规法)

3.1.1 供试液的制备 样品10 ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml，充分摇匀制成1:10的供试液。

3.1.2 试验组 薄膜过滤法，取两只已灭菌的可拆卸集菌器，先泵入100 ml左右的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，再泵入20 ml上述供试液，混匀，过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，冲洗滤膜3次，每次100 ml，在最后一次淋洗液中分别接入1 ml已制备好的菌液，取出滤膜，菌面朝上贴于琼脂培养基平板上培养。重复上述操作，做完其余的试验菌。每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

3.1.3 供试品对照组 验组的方法处理，不加菌液，菌面朝上贴于相应的培养基培养。

3.1.4 菌液组 1 ml上述制备的菌液，直接接种于平皿，加入相应的培养基培养。

3.1.5 稀释剂对照组 直接以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代供试品，其余试验操作同试验组。

3.2 培养 营养琼脂培养平皿倒置于30℃ ～35℃下培养3 d;将玫瑰红钠琼脂培养平皿倒置于23℃ ～28℃下培养5 d。

3.3 观察和计数 平皿逐日检查计数，结果以培养终了时的计数方法为准，并将每组试验中接有相同试验菌株的2个平皿计数进行平均，取平均值。

表1 菌液组计数结果(CFU/ml)

表2 薄膜过滤法试验组回收率(%)

表3 薄膜过滤法稀释剂对照组回收率(%)

供试品对照组的细菌总数和霉菌总数均＜1个/g，根据以上结果:在三次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率和试验组的菌回收率均大于70%。

4 控制菌检查法

4.1 供试液的制备 同菌落计数法。

4.2 试验组 采用薄膜过滤法，取两只已灭菌的可拆卸集菌器，先泵入100 ml左右的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，再泵入20 ml上述供试液，混匀，过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，冲洗滤膜3次，每次100 ml，在最后一次淋洗液中加入已制备好的菌液(其中一管加入1 ml的大肠埃希菌菌液，另一管加入1 ml的铜绿假单胞菌菌液)。取出滤膜，分别放至100 ml的胆盐乳糖培养基中。同以上操作，在最后一次淋洗液中加入金黄色葡萄球菌菌液，取出滤膜，放至100 ml的硫乙醇酸盐流体培养基。置30℃ ～35℃培养箱培养24～48 h。

4.3 阴性对照组 方法同试验组，用金黄色葡萄球菌作为大肠埃希菌的阴性对照菌，用大肠埃希菌作为金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的阴性对照菌。置30℃ ～35℃培养箱培养24～48 h。

4.4 结果 取接有大肠埃希菌的试验组及其阴性对照组的培养物0.2 ml，分别接种至5 mlMUG培养管内，30℃ ～35℃培养箱培养5～24 h，取未接种的MUG培养管作本底对照，将各管置365nm紫外光灯下检视，如有大肠埃希菌生长应呈现荧光，然后加数滴靛基质试液，结果见表4。

表4

取接有铜绿假单胞菌的试验组及其阴性对照组的培养物，划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，30℃ ～35℃培养箱培养18～24 h。结果:试验组菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润，灰白色，周围时有蓝绿色色素扩散。表示有典型的铜绿假单胞菌生长。阴性对照组没有检出铜绿假单胞菌。

取接有金黄色葡萄球菌的试验组及其阴性对照组的培养物，划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养24～72 h。结果:试验组菌落呈金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有黄色环，菌落直径0.7～1 mm。表示有典型的金黄色葡萄球菌生长。阴性对照组没有检出金黄色葡萄球菌。

根据以上结果，本品控制菌检查采用薄膜过滤法，培养基用量为100 ml。

5 小结

盐酸阿扑吗啡鼻喷剂的微生物限度检查方法对微生物生长没有抑制性影响。因此，此方法验证通过。

［1］ 苏德模，马绪荣.药品微生物学检验技术.华龄出版社，2007:277-316.

［2］ 国家药典委员会.中国药典.(二部).中国医药科技出版社，2010:附录 107-116.