猪脂联素球状结构域gAd 蛋白在重组乳酸乳球菌中表达条件的优化

杨虹坤，刘霭莎，胡文锋，李岩，吴同山，王进军

1(华南农业大学食品学院应用微生物研究室，广东 广州，510642) 2(东莞市畜牧科学研究所，广东 东莞，523320)

脂联素(adiponectin)是动物脂肪细胞分泌的一种蛋白类细胞因子。研究表明，脂联素与肥胖、动脉粥样硬化、胰岛素抵抗、Ⅱ型糖尿病，以及机体能量稳态等方面有密切关系［1－4］。脂联素能够调控动物和人体的能量稳态、葡萄糖代谢和脂肪代谢，是与脂肪沉积呈负相关的脂肪细胞特异性蛋白。猪脂联素蛋白由243 个氨基酸组成，一级序列分析包含4 个功能区:前17 个氨基酸组成的信号肽、23 个氨基酸组成的氨基端非螺旋功能区(N 端)、一段22 个胶原重复序列(包含8 个重复Gly-X-Pro 及14 个重复Gly-XY)组成的胶原区和137 个氨基酸组成的羧基端球状区(C 端)［5］。脂联素在体内循环中以全长型结构(full-length adiponectin，Ad)和较小的C 端球状结构域(globular adiponectin，gAd)两种形式存在［6］。脂联素羧基端的球状区是脂联素蛋白生物活性的关键部位，有研究报道该球状结构域单独作用具有更强的生物活性［7］。

乳链球素表达系统(nisin-control gene expressions，NICE 系统)是一种被广泛研究和运用的乳酸菌食品级诱导表达系统，常以乳链球菌素(nisin)作为目的蛋白表达的诱导剂，而乳链球菌素是运用于食品生产加工中的食品级防腐剂。在NICE 系统的调节过程中，组氨酸激酶nisK 作为nisin 的传感器，nisR蛋白作为反应调节子，激活靶基因的转录。nisR 和nisK 组成双组分调节系统。nisin 存在时，结合到nisK 上，nisK 通过磷酸化激活nisR，被激活的nisR 在nisA 启动子处诱导nisin 操纵子［8－9］。nisK 和nisR基因已经被分离并整合于适当宿主菌的染色体上，nisA 启动子也已被分离并位于质粒载体上。当目的基因被克隆到这个启动子的下游，并被转化进含有nisR 和nisK 的宿主菌中，这个基因的表达便可以通过nisin 来激活。

目前在国内外对脂联素的研究中，对于不同的表达载体，脂联素的表达量不尽相同，张国栋等用大肠杆菌表达系统表达脂联素，结果重组全长脂联素占总细胞蛋白的35%，脂联素球状结构域占总蛋白的22%［10］。王云龙等在脂联素原核表达的研究中，其表达量约占菌体总蛋白的30%［11］。Tullin 等在动物细胞和酵母菌表达分别表达人和鼠脂联素基因时，表达产物经纯化后得到的重组鼠脂联素蛋白含量在10 ～30mg/kg，而人脂联素蛋白在动物细胞核酵母菌表达量为5 ～15 mg/kg［12］。刘霭莎等在乳酸乳球菌中表达了猪脂联素球状结构域基因，通过检测蛋白相对分子质量约为17kDa［13］，本文在此基础上进一步研究gAd 基因最佳表达条件，为今后此基因工程菌工业化发酵生产奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

刘霭莎等构建的猪脂联素球状区域基因的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)原核表达系统L. lactis NZ9000-gAd［13］。

1.1.2 试剂

M17 肉汤培养基，青岛海博生物公司;氯霉素(Cm)、TEMED、SDS，北京普博欣生物公司;nisin，Sigma 公司产品;蛋白质Marker MP102，天根生化科技公司;30%丙烯酰胺，广州美津生物技术公司。

1.1.3 培养基

表达条件优化试验培养基:改良的M17G 培养基［14］。

培养基优化试验培养基:5%乳糖，1%酵母膏，1.5% 大 豆 蛋 白 胨，1mmol/L MgSO4，0.01g/L Na2HPO4［15］，用氯霉素作为抗性选择性标记，pH 值为7。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化

将－20 ℃保存的重组L. lactis NZ9000-gAd 接种于M17G 培养基(含5 ng/mL 氯霉素)，30 ℃培养48 h。挑取单菌落接种于含5mL M17G(含5ng/mL 氯霉素)液体培养基的试管中，培养12 h。

1.2.2 诱导剂浓度对gAd 蛋白表达的影响

将已活化的菌液接到含M17G(含5ng/mL 氯霉素)液体培养基的试管中，30 ℃培养2.5h 后，加入浓度分别为10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL 的诱导剂nisin，诱导培养6h，4 ℃离心收集菌体，经溶菌酶作用1h 后煮沸10 min，离心弃上清，用SDS-PAGE 电泳检测分析，蛋白表达量分析采用BandScan 分析软件。

1.2.3 诱导后培养温度对gAd 蛋白表达的影响

接种操作同上，细胞培养2.5h 后，加入终浓度10ng/mL 的诱导剂nisin 后，分别置于20，25，30，35，40，45 ℃的恒温培养箱中培养6h 后收集菌体，检测方法同上。

1.2.4 诱导时间点( OD) 对gAd 蛋白表达的影响

接种操作同上，接种后于不同时间测定OD600值，分别当OD600≈0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 时，加入终浓度为10 ng/mL 的诱导剂nisin，30 ℃培养6h 后，检测方法同上。

1.2.5 乳糖浓度对gAd 蛋白表达的影响

按1% 的接种量分别接种于乳糖浓度为4%、5%、6%、7%、8%的培养基中，将pH 值调至7，30 ℃恒温培养箱中静置5h 后开始诱导，采用已获得的最佳诱导条件，用SDS-PAGE 检测目的蛋白表达情况。

1.2.5 氮源浓度对gAd 蛋白表达的影响

基础培养基中由于使用非单一氮源，而是酵母膏与大豆蛋白胨的复合氮源，因此在进行氮源筛选前，研究了酵母膏与大豆蛋白的最佳配比，为1∶2(酵母膏∶大豆蛋白胨)。将氮源总浓度设定为2%、3%、4%、5%、6%。培养条件同上。

1.2.6 磷酸盐浓度对gAd 蛋白表达的影响

将基础培养基中的Na2HPO4浓度设定为0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%，将pH 值调至7，培养条件同上。

1.2.7 无机盐浓度对gAd 蛋白表达的影响

将已活化的菌种按1%的接种量分别接种于Mg-SO4浓度为0.01%、0.02%、0.03%、0.04%的基础培养基中，培养条件同上。

2 结果与分析

2.1 诱导剂浓度对gAd 蛋白表达的影响

结果如图1 所示，采用BandScan 分析软件得出gAd 蛋白在nisin 浓度为20ng/mL 时蛋白表达量最高。从20ng/mL 开始随着诱导剂Nisin 浓度的升高目的蛋白表达量反而降低，说明过高的浓度会抑制蛋白的表达，nisin 是一种天然防腐剂，具有一定的抑菌作用，浓度过高时诱导后菌体量明显降低。因此可以确定诱导剂nisin 的最佳浓度为20 ng/mL。

图1 不同诱导剂浓度对蛋白表达影响的SDS-PAGE 分析图Fig.1 Results of SDS-PAGE electrophoresis for the amount of added nisin

2.2 诱导后培养温度对gAd 蛋白表达的影响

结果如图2 所示gAd 蛋白在诱导后培养温度为25 ℃时表达量最高，从25 ℃开始随着温度的升高，蛋白表达量反而降低。诱导后培养温度是影响蛋白表达量的重要因素之一，若温度过低菌体生长缓慢，新陈代谢速度也随之降低，细胞活性降低，不利于细胞合成外源蛋白;若温度过高，菌体培养后期容易衰老自溶，合成的外源蛋白不稳定。因此可知重组乳酸菌的最佳诱导后的培养温度为25 ℃。

图2 不同诱导后培养温度对蛋白表达影响的SDS-PAGE 分析图Fig.2 Results of SDS-PAGE electrophoresis for the induction temperature

2.3 诱导时间点对gAd 蛋白表达的影响

结果如图3 所示，gAd 蛋白在OD600为0.4 时表达量相对较高。菌体密度影响蛋白的表达，一般菌体密度与蛋白表达量成正相关关系。过早表达外源蛋白不利于菌体的生长，影响菌体密度，并且表达外源蛋白对菌体本是一种负载，而且过量表达会引发细胞产生应激反应［16］。由此得出当OD600为0.4 时为最佳的诱导菌体密度。

图3 不同诱导时间点对蛋白表达影响的SDS-PAGE 分析图Fig.3 Results of SDS-PAGE electrophoresis for the time point of induction

2.4 乳糖浓度对gAd 蛋白表达的影响

结果如图4 所示，在乳糖浓度为7% 时gAd 蛋白的表达量最高。乳糖的浓度对细胞生长有很大的影响，浓度过低不利于细胞的生长，菌体得不到足够的营养生长受到抑制，浓度过高会产生反馈抑制作用，引起菌体异常，对菌体代谢、产物合成及氧的传递会产生不良影响［17］，细胞在最适营养环境中正常生长，得到较高的细胞密度，是获得蛋白高效表达的保障。由此可知脂联素重组乳酸菌的最佳碳源浓度为7%。

图4 不同乳糖浓度对蛋白表达影响的SDS-PAGE 分析图Fig.4 Results of SDS-PAGE electrophoresis for the concentration of lactose

2.5 氮源浓度对gAd 蛋白表达的影响

结果如图5 所示，在氮源浓度为3%时获得的gAd 蛋白表达量较高。氮源浓度对菌体生长以及合成蛋白有极显著影响。如果一次性投入氮源过多，易引起菌体生长过盛而使培养基的营养成分过早耗尽，导致菌体过早衰老而自溶，缩短蛋白合成时间;反之氮源浓度过低，菌体生长和蛋白的合成均停止［18］。由此可确定重组乳酸菌的最佳氮源浓度为3%。

图5 不同氮源浓度对gAd 蛋白表达影响的SDS-PAGE 分析图Fig.5 Results of SDS-PAGE electrophoresis for the concentration of nitrogen source

2.6 磷酸盐(Na2HPO4)浓度对gAd 蛋白表达的影响

结果所图6 所示，在Na2HPO4浓度为0.25%时的蛋白表达量较高，磷酸盐的含量影响菌体的生长及基因产物的表达，基质中磷酸盐的含量影响表达质粒的复制速度［19］。当磷酸盐含量低时由于不能满足生长需求，菌体密度过低;当浓度过高时，早期菌体旺盛，导致菌体过早衰老，菌体密度依然不能达到较高值。乳酸菌发酵的终产物主要是乳酸，在同型发酵产酸的过程中，乳酸积累到一定的量，会使pH 值降低，影响其生长环境，抑制菌体的生长［20］。由此可以确定Na2HPO4的最佳浓度为0.25%。

图6 不同Na2HPO4 浓度对gAd 蛋白表达的SDS-PAGE 分析图Fig.6 Results of SDS-PAGE electrophoresisfor the concentration of Na2HPO4

2.7 无机盐(MgSO4)浓度对gAd 蛋白表达的影响

结果如所7 所示，当MgSO4浓度为0.02%时蛋白表达量最高。Mg2+对性细胞活性起到很大作用，是细胞进行新陈代谢时，酶的催化剂，适量的Mg2+能促进细胞的生长，加速各种代谢途径中酶的催化反应，但是过高的Mg2+浓度会造成细胞对金属离子中毒，而不利于菌体生长。因此确定脂联素重组乳酸菌的最适MgSO4浓度为0.02%。

图7 不同MgSO4 浓度对gAd 蛋白表达影响的SDS-PAGE 分析图Fig.7 Results of SDS-PAGE electrophoresis for the concentration of MgSO4

2.8 诱导表达条件正交实验的结果

根据单因素试验得到的结果选择三个水平进行正交试验，试验结果见表1，极差R 值大小顺序为:B(温度)＞A(诱导剂浓度)＞C(诱导时间点)，较优的诱导条件组合是A3B2C2。因此，最终确定脂联素重组乳酸乳球菌的最佳诱导条件为:诱导剂nisin 的浓度为30 ng/mL、诱导后培养温度为25 ℃、诱导时间点为OD600为0.4。

表1 诱导表达条件正交试验结果及其极差分析Table 1 Results of orthogonal experiment of induction conditions and analysis of its range

2.9 培养基优化的正交实验结果

根据单因素试验得到结果选择3 个水平进行正交试验，试验结果见表2，极差的大小顺序为:B(氮源浓度)＞A(乳糖浓度)＞D(MgSO4浓度)＞C(Na2HPO4浓度)。所以由正交试验得出的最佳培养基组合为A2B3C2D2。因此，最终确定脂联素重组乳酸乳球菌的最佳培养基组分为:乳糖浓度7%、氮源浓度 4%、Na2HPO4浓 度 0.25%、MgSO4浓 度0.02%。

表2 培养基优化正交试验结果及其极差分析Table 2 Results of orthogonal experiment of cultural medium and analysis of its range

3 结论

重组基因工程菌表达条件的优化，一般都是从诱导条件和营养条件方面进行，诱导剂浓度及诱导时菌体密度会影响外源蛋白的表达水平，菌体密度一般控制在菌体的对数生长期或对数中后期。乳酸乳球菌的最适生长温度是在30 ℃，而质粒稳定和目的蛋白的诱导温度大多为25 ℃，因此基因工程菌的发酵过程可分为生长和表达两个阶段，有利于提高细菌的生长密度和重组产物的表达量。要获得高效表达目的蛋白，培养基各组分的浓度和比例要适当，过量的营养物质反而会抑制菌体的生长，特别是碳源和氮源浓度。本文从以上几个方面对重组脂联素乳酸乳球菌进行了优化，最终蛋白表达量达到29.4%，为今后工业化生产脂联素基因工程菌提供了数据。

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