一种快速测定可溶性糖的新方法:TBA法

王 妍，胡 胜，付文成，张倩楠，王凤德，邱念伟,2

一种快速测定可溶性糖的新方法:TBA法

王 妍1，胡 胜1，付文成1，张倩楠1，王凤德，*邱念伟1,2

（1. 曲阜师范大学生命科学学院，山东，曲阜 273165； 2. 山东省农业科学院蔬菜研究所，山东，济南 250100）

可溶性糖在植物生命活动中具有重要作用，其含量是植物生理学的常测指标。本研究提供了一种快速测定可溶性糖的新方法—2-硫代巴比妥酸（TBA）法，并将该种方法与最为常用蒽酮法进行了比较，总结了TBA法的优缺点，为相关研究提供参考。

硫代巴比妥酸；蒽酮；可溶性糖；测定方法

糖类是自然界中分布最为广泛的有机化合物，是植物的主要营养物质之一，它不仅是维持植物生命活动的主要能源，还是合成纤维素、蛋白质、脂肪、核酸等各类有机化合物的原料，并参与植物的信号传导、渗透调节、抗逆性等各类生命活动。因此，在植物生理学实验中经常测定可溶性糖的含量。

测定可溶性糖含量的方法有多种：如蒽酮法[1]、苯酚法[2]、费林试剂(Fehling's solution)法[3]、液相色谱法[4]等。上述方法的用途显著不同：蒽酮法和苯酚法测定的是碳水化合物总含量，即样品中的单糖以及在测定条件下能水解成单糖的双糖、寡糖以及多糖(淀粉、纤维素)等；还原性总糖含量的测定则常用费林试剂法；液相色谱法可以灵敏测定各种成分的糖的含量，但测定过程比较复杂，成本较高。在植物生理学实验中，蒽酮试剂法因其灵敏、快速、简便而最为常用。但是，蒽酮法有很多缺点：一是该法要使用浓硫酸，操作不慎易出现安全事故；二是样品提取方法不同，显色条件不同，实验结果差异较大；三是干扰因素较多，实验精度不高；四是样品的提取过程长，且需要多步抽提和脱色，步骤相对繁琐[5]。

植物在逆境条件下，都会受到过氧化伤害，植物过氧化伤害程度常用2-硫代巴比妥酸（2-Thiobarbituric acid，TBA）法测定丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量表示。在此方法中，糖会对MDA的显色反应产生干扰，因此需要根据双组分光光度法建立方程，求出糖的浓度，以消除糖对MDA显色的干扰[6]。在此实验方法中虽可求出的糖的浓度，但一直未受到关注。通过查阅文献和实验测定结果显示，该法求出的糖的浓度与蒽酮法结果相似，是一种更为简单、方便可溶性总糖的测定法。文献已经证明：在酸性和高温条件下，糖可与TBA反应生成黄色物质，其最大吸收波长在450 nm，可用OD450直接计算出可溶性糖的浓度。不过，葡萄糖与TBA反应颜色甚浅，浓度高达25 mmol/L时，OD450仅为0.08，但果糖与TBA反应的颜色很深，并且同一浓度葡萄糖与果糖和TBA反应的吸光度（OD450）之和恰好等于同一浓度蔗糖的吸光度[6]。因此可以用蔗糖作为标准，绘制糖与TBA反应的标准曲线。本研究对TBA法和蒽酮法测定可溶性糖含量进行了比较分析，总结了两类方法的优缺点，供同行参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

取结球期大白菜()的芯叶（去除大叶脉）作为测试对象。每个对象测定5个重复。

1.1 实验方法

1.1.1 蒽酮法测定可溶性总糖含量

蒽酮法测定可溶性总糖含量的样品提取过程参照张志良2003年的方法[1]，标准溶液或样品提取液取1 mL，加入蒽酮试剂5 mL，混合后沸水浴10 min，625 nm处测定OD值。蒽酮法中用0~0.6 μmol/L的葡萄糖绘制葡萄糖标准曲线，用0~0.3 μmol/L的蔗糖绘制蔗糖标准曲线，标样OD值测定方法同上。

1.1.1 TBA法测定非还原性糖含量

TBA法测定可溶性糖含量参考文献测定MDA的方法，稍加改动[1,6]。MDA与TBA的反应产物3,5,5-三甲基恶唑-2,4-二酮（红棕色）在532 nm处有最大光吸收，可溶性糖与2-硫代巴比妥酸反应生成的黄色物质，其最大吸收波长在450 nm，但在532 nm处也有较强的光吸收，因此干扰MDA含量的测定。但由于450 nm是其特征峰，因此可以精确测定出可溶性糖的含量，并计算出其对MDA含量的干扰。糖类与TBA反应需要一定浓度的Fe3+，因此在10%的三氯乙酸溶液中加入一定量FeCl3，使Fe3+的终浓度为6 μmol/L。

MDA和糖类的提取：取1 g白菜叶片，加入1 mL 10%的三氯乙酸和少量石英砂研磨，研成匀浆后再加入4 mL 10%的三氯乙酸继续提取，匀浆在4000 × g离心力下离心10 min，上清液即为样品提取液。

显色反应及测定：取2 mL提取液放入具塞试管中，再加入2 mL 0.6%的TBA溶液（用含6 μmol/L Fe3+的10%三氯乙酸配制），混匀，加盖后置于沸水浴中显色15 min。冷却后，离心，取上清液，450 nm和532nm处测定OD值。TBA法中用0~200 μmol/L的葡萄糖绘制葡萄糖标准曲线，用0~10 μmol/L的蔗糖绘制蔗糖标准曲线，标样OD值测定方法同上。利用下列经验公式可以计算出糖与MDA的浓度[1]。

糖浓度的经验计算公式：C (μmol/mL) = 11.71× OD450

MDA浓度的经验计算公式：C (nmol/mL) = 6.45OD532-0.56 OD450

2 结果与分析

2.1 TBA法与蒽酮法标准曲线的相关性与灵敏性比较

2.1.1蒽酮法的葡萄糖和蔗糖标准曲线

蒽酮法是植物生理生化实验中测定可溶性总糖的最常用方法，从图1标准曲线可以看出，该法非常灵敏，能检测出待测溶液中0.1 μmol/mL浓度的糖浓度；而且该法的稳定性较好，不论是蔗糖标准曲线、还是葡萄糖标准曲线，糖浓度与OD625的直线关系均非常显著，相关系数R均大于0.999。两种标准曲线基本一致，葡萄糖标准曲线的回归系数为1.2603(图1A)，蔗糖标准曲线的回归系数为2.5982(图1B)，基本接近1:2的比例关系（1 μmol蔗糖相当于2 μmol葡萄糖）。

2.1.2 TBA法的葡萄糖和蔗糖标准曲线

TBA法主要用来测定过氧化产物丙二醛的含量，测定过程中可求出糖的浓度，主要用于消除糖对丙二醛测定的干扰[1]。但该法中测定的糖浓度是否可靠，还没有文献论证。该法测定糖浓度不用多次抽提样品，样品提取速度快，也不用活性炭脱色，且不用使用浓硫酸，更为快速、简单、安全。如果该法测定的糖浓度较为可靠，将为可溶性糖的测定提供一种新的可选方法。图2结果显示，葡萄糖和蔗糖与TBA反应产物在450 nm的吸光度与糖浓度均具有较好的线性关系，相关系数R均大于0.99。但是葡萄糖与TBA反应生成的黄色物质颜色较浅，200 μmol/ml 葡萄糖的吸光度仅为0.84（图2A）。葡萄糖和蔗糖标准曲线的回归系数分别为0.0043和0.1003（图2A、B），这样TBA法测定蔗糖灵敏度是葡萄糖的23.3倍。但文献已经证明，同一浓度葡萄糖与果糖和TBA反应的吸光度（OD450）之和恰好等于同一浓度蔗糖的吸光度[6]。所以TBA法必须用蔗糖做标准曲线。如果用葡萄糖作为标准曲线，实验结果会偏低。另外，如果实验样品中葡萄糖与果糖的摩尔比大于1或者小于1，实验结果会偏大或者偏小。因此TBA法测定可溶性糖的精确度低于蒽酮法，不能精确测定葡萄糖或果糖含量较高的样品。

图1 蒽酮法糖溶液标准曲线

图2 TBA法糖溶液标准曲线

2.2 蒽酮法与TBA法测定白菜叶片可溶性糖结果比较

以白菜芯叶为实验材料，比较了两种测定方法的稳定性和可靠性。图3结果显示，如果用蔗糖做标准曲线，两种测定方法测定结果差异不显著(> 0.05)。TBA法测定结果稍有偏高，可能是由于糖的提取液未进行活性炭脱色，提取液的本底颜色稍有淡黄色所引起。而用文献中的经验公式计算糖浓度，实验结果显著高于Ⅰ和Ⅱ(图3) (< 0.05)。因此可以认为，经验公式所推测结果并不可靠，回归系数可能偏大。建议用TBA法测定可溶性糖含量时也做标准曲线。

Ⅰ为蒽酮法测定结果（用蔗糖为标准曲线计算）；Ⅱ为TBA法测定结果（用蔗糖为标准曲线计算）；Ⅲ为TBA法测定结果（用经验公式计算）

3 讨论

从图1B和图2B可以看出，TBA的灵敏度远不如蒽酮法，如蒽酮法测定蔗糖标准曲线的回归系数是2.5982，TBA测定蔗糖标准曲线的回归系数是0.1003，蒽酮法灵敏度是TBA法的25.9倍。不过植物叶片中的可溶性糖含量较高，测定时仅需1 g鲜重的叶片，提取液与TBA反应产物的OD450在0.5左右，吸光度在可测范围之内，测定结果可靠。两种方法测定结果的方差具齐性(< 0.05)，说明两种方法的测定结果可靠性一致。

TBA法测定可溶性糖优缺点和测定时注意事项总结如下。

① TBA法的灵敏性和精确度不如蒽酮法。

② TBA法测定结果与蒽酮法基本一致（< 0.05），测定的OD值在0.5左右，结果比较可靠。

③ TBA法测定可溶性糖的步骤简单，样品提取快速，操作相对安全。

④ TBA法可以同时测出丙二醛含量，在逆境植物学研究中更为实用。

⑤ TBA的经验公式求出的可溶性总糖浓度偏高，建议测定时做标准曲线。

⑥ TBA法必须用蔗糖做标准曲线。

⑦ TBA法测定的是植物材料中的总可溶性糖浓度。

⑧ TBA法可以用于植物材料中可溶性总糖含量的定性测定。

[1] 张志良, 瞿伟菁. 植物生理学实验指导[M]. 3版.北京:高等教育出版社, 2003:127-128.

[2] 郭晓蕾, 朱思潮, 翟旭峰, 等. 硫酸蒽酮法与硫酸苯酚法测定灵芝多糖含量比较[J].中华中医药学刊, 2010, 9: 210-212.

[3] 叶海辉, 何秀芬, 王秀兰. 费林试剂滴定法测定还原糖方法的改进[J].热带农业科学, 2001, 3: 9-11.

[4] 邹青松, 陈山, 王晓, 等. 瑶山甜茶可溶性糖的测定[J]. 食品工业科技, 2011, 1:296-299.

[5] 熊福生; 高煜珠. 植物组织可溶性糖含量(蒽酮法)最佳测定条件的选择[J]. 江苏农学院学报, 1988, 3: 56, 60.

[6] 赵世杰, 许长成, 邹琦,等. 植物组织中丙二醛测定方法的改进[J]. 植物生理学通讯, 1994, 3: 207-210.

A NEW METHOD FOR FAST DETERMINATION OF TOTAL SOLUBLE SUGAR CONTENTIN PLANT TISSUE: TBA-METHOD

WANG Yan1, HU Sheng1, FU Wen-cheng1, ZHANG Qian-nan1, WANG Feng-de,*QIU Nian-wei1,2

(1. College of Life Science, Qufu Normal University, Qufu, Shandong 273165, China; 2. Vegetable Research Institute, Shandong Academy of agricultural Sciences, Ji’nan, Shandong 250100, China)

Because soluble sugar play an important role in life of plants, so soluble sugar content was measured frequently in plant physiology research. A novel method (TBA method) for determining soluble sugar contentwas described in this paper. The advantages and disadvantages of this method was demonstrated by comparing with the most common anthrone-method, which could provide reference for correlational research.

2-Thiobarbituric acid, TBA; anthrone; soluble sugar; determination method

Q5-33

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2013.03.009

1674-8085(2013)03-0001-06

2013-02-10；

2013-04-02

国家自然科学基金项目(31101553)；作物生物学国家重点实验室开放课题项目(2011KF07)

王 妍(1987-)，女，山东滕州人，硕士生，主要从事植物生理生化研究(E-mail:seven86good@163.com)；

胡 胜(1992-)，男，山东青岛人，曲阜师范大学生命科学学院本科生(E-mail:404681942@qq.com)；

付文成(1992-)，男，山东寿光人，曲阜师范大学生命科学学院本科生(E-mail:347174767@qq.com)；

张倩楠(1991-)，女，山东曲阜人，曲阜师范大学生命科学学院本科生(E-mail:1124898858@qq.com)；

王凤德(1979-)，男，山东临沂人，博士后，主要从事蔬菜生理研究(E-mail:wfengde@163.com)；

*邱念伟(1976-)，男，山东嘉祥人，副教授，博士，硕士生导师，主要从事逆境植物学研究(E-mail:nianweiqiu@163.com).