补气化痰方对氧化低密度脂蛋白诱导血管内皮细胞损伤的保护作用

陈 ，郜俊清，金惠根，刘宗军，赵德强

(上海中医药大学附属普陀医院心内科，上海 200062)

补气化痰方对氧化低密度脂蛋白诱导血管内皮细胞损伤的保护作用

(上海中医药大学附属普陀医院心内科，上海 200062)

目的：研究补气化痰方对氧化低密度脂蛋白诱导血管内皮细胞损伤后的影响及可能的机制。方法：将经氧化低密度脂蛋白损伤血管内皮细胞分为5组：补气化痰方药物血清低、中、高剂量组，模型组和正常对照组。用MTT法观察补气化痰方药物血清对经氧化低密度脂蛋白损伤血管内皮细胞抑制作用的保护；采用westernblot检测法测定细胞VEGF蛋白水平探讨其可能的机制。结果：补气化痰方药物血清能减少经氧化低密度脂蛋白诱导血管内皮细胞损伤生长的抑制，并通过上调VEGF蛋白途径达到抑制氧化低密度脂蛋白对血管内皮细胞的损伤。结论： 补气化痰方对氧化低密度脂蛋白导致对血管内皮细胞损伤有保护作用，其可能的机制是上调VEGF蛋白表达实现。

补气化痰方；瓜蒌薤白半夏汤；氧化低密度脂蛋白；血管内皮细胞；VEGF

血脂代谢紊乱其中低密度脂蛋白(LDL)的上升是动脉硬化形成的主要因素,低密度脂蛋白经过氧化修饰后，将生成氧化低密度脂蛋白(OXLDL),氧化低密度脂蛋白与低密度脂蛋白相比具有更强的致动脉粥样硬化的作用。一些研究证实，氧化低密度脂蛋白能够通过细胞凋亡的途径诱导血管内皮细胞死亡[1-5]。张仲景的《金匮要略》中论到，瓜蒌薤白半夏汤主要治疗痰盛瘀阻型胸痹，而心肌梗死真心痛，其病机多为气虚，并兼有痰浊瘀阻，故课题组在经典方的基础上，增加了黄芪，补气用以行气，使经典方既拥有化痰祛邪的作用，又兼顾补气扶正的作用。研究显示，黄芪能够促进血管内皮细胞增殖，瓜蒌薤白半夏汤能够增加血管内皮细胞生物学活性。本研究观察补气化痰方对氧化低密度脂蛋白对血管内皮细胞损伤是否具有保护作用及可能存在的机制。

1 材料与仪器

1.1 血管内皮细胞采用猪髂动脉内皮细胞株(PIEC)，来自中国科学院上海分院细胞所提供；氧化低密度脂蛋白，由上海亚培生物有限公司提供；补气化痰方：黄芪、瓜蒌、半夏、薤白，经过大火煮沸后再用小火继续烧20min，将药液烧至约100mL，再依照不同分组浓度为正常人使用剂量的2、4、8倍，根据大鼠与人体体表面转换，大鼠需要服药剂量为0.9mL/100g。

1.2 动物清洁级SD大鼠共20只，8～12周龄，雄性，体质量约(250±30)g。动物饲养按照动物伦理委员会相关规定。

1.3 主要试剂MTT，由sigma公司提供；细胞培养液DMEN(高糖)，由GIBCOE公司提供；细胞裂解液，由碧云天生物公司提供；VEGF一抗，由Stressgen公司提供；Westernblot二抗，由sigma公司提供；封闭液，由碧云天生物公司提供。

1.4 主要设备分光光度计bio-photometer，由eppendorf公司提供；酶联免疫检测仪Model680，由BIO-RAD公司提供；高速离心机centrifuge5804R，由eppendorf公司提供；低速离心机centrifuge5702，由eppendorf公司提供。

2 方法

2.1 药物血清制备 雄性SD大鼠80只，随机分为补气化痰高、中、低剂量组和空白对照组，每组20只，补气化痰方组按照分组要求给予灌胃(药物使用量等同于临床用量的2、4、8倍)，对照组进行等体积的0.9%氯化钠灌胃，1d给药2次，共5d，最后一次灌胃前不禁水、禁食12h。末次给药后1h，腹腔注射2.5%戊巴比妥钠麻醉，无菌条件下分离腹主动脉取血，静置血液2h，再经过3 000r/min离心10min，取离心上清液3mL左右，56 ℃水浴灭活30min，用微孔滤膜0.22μm除菌，分装，-20 ℃进行冻存备用。

2.2 培养液的配制 将10gDMEN干粉加入900mL三蒸水中，再加入10mL双抗，并加入NaHCO3，HEPES，用0.22μm微孔滤膜除菌。

2.3 细胞的传代 血管内皮细胞采用已配制好的10%高糖DMEN培养,在37 ℃、5%CO2饱和湿度的条件下培养。干预时在细胞未对数生长期时，将细胞悬液依照1:2速率传代细胞。

2.4 实验分组 1)对照组(正常鼠血清培养液)；2)模型组(正常鼠血清培养液+200μg/mLOXLDL)；3)治疗组：不同剂量含药鼠血清培养液+200μg/mLOXLDL。

2.5 细胞处理当血管内皮细胞生长至80%,用0.25%胰酶进行消化，在血球板上进行细胞计数，将血管内皮细胞悬液浓度调整到5×104个/mL。将细胞接种到96孔培养板中,每孔中加入100μL细胞悬液。培养12h后，根据分组加入不同鼠血清培养液200μL。培养2h后在培养孔中加入OXLDL使其在治疗组及模型组的药物终末浓度为200μg/mL。

2.6 不同浓度的补气化痰方对经氧化低密度脂蛋白损伤血管内皮细胞生长的影响 将血管内皮细胞培养2d，每组重复5孔，加入MTT，4h后，加入DMSO混匀，测定540nm波长处的吸光值(OD值)。

2.7 补气化痰方对OXLDL损伤PIEC后细胞内VEGF的表达 将经过处理的细胞培养48h后,将400μL含PMSF的裂解液加入每瓶细胞中，然后将液体移至离心管中，经过4 ℃、12 000r/min离心5min，取上清液分装于EP管中。提取蛋白，取40μg蛋白上样进行电泳，待溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。分别进行一抗及二抗反应。最后在暗室中显影、定影，晾干。凝胶图象分析。

3 结果

3.1 各种浓度的补气化痰方对经氧化低密度脂蛋白损伤大鼠血管内皮细胞后生长的影响 补气化痰方在10%血清下能有效抑制OXLDL对血管内皮细胞生长的抑制作用,在3个不同剂量浓度范围内其浓度与抑制作用呈正线性相关，图1。

在相同时间条件下，与模型组比较#P<0.05。 图1 不同浓度补气化痰方对经OXLDL损伤大鼠血管内皮细胞后生长的影响

图2 补气化痰方对经OXLDL损伤PIEC后VEGF蛋白的影响

图3 补气化痰方对经OXLDL损伤PIEC后VEGF蛋白的影响

3.2 补气化痰方对OXLDL损伤PIEC后细胞内VEGF的表达 经过OXLDL损伤后的血管内皮细胞，其抑凋亡蛋白Bcl-2呈现高表达，促凋亡蛋白BAX呈现低表达，但是经含补气化痰方药物血清预处理过后，BAX表达明显下调，Bcl-2表达明显上调(P<0.05)，见图2、图3。

4 讨论

冠心病在《黄帝内经》中就有记载。中医称冠心病为胸痹，在患者症状方面有记载，《素问·藏气法时论篇》说：“心病者，胸中痛，胁支满，胁下痛，膺背肩胛间痛，两臂内痛。”对重症胸痹患者，《灵枢·厥论》篇指出：“真心痛，手足青至节，心痛甚，旦发夕死，夕发旦死。”

LDL升高是血管动脉粥样硬化形成的主要因素，低密度脂蛋白经过氧化作用后，转变成为氧化低密度脂蛋白(OXLDL)，氧化低密度脂蛋白具有较低密度脂蛋白更强的致动脉粥样硬化的作用。一些研究证实，氧化低密度脂蛋白能够通过细胞凋亡的途径诱导血管内皮细胞死亡[1-5]。目前研究显示，胸痹冠心病病机多为气虚、痰浊、血瘀[6-8]。张仲景《金匮要略》中瓜蒌薤白半夏汤主要治疗痰盛瘀阻型胸痹。心肌梗死真心痛病机特点多为气虚，也兼有痰浊瘀阻，故课题组在经典方的基础上，增加黄芪补气药物，主要为了补气以行气，使金匮要略经典组方既具备化痰祛邪的作用，又具有补气扶正的作用。近期研究[9-11]显示，瓜蒌薤白半夏汤能改善冠状动脉内皮的功能，以达到减少心肌损伤，并可改善缺血引起心绞痛的症状，并有降低血脂作用。本研究在金匮要略经典方基础上，大剂量使用补气药物黄芪，旨在补气以行气，祛邪兼扶正。

本研究显示，补气化痰方能抑制氧化低密度脂蛋白对血管内皮细胞生长的抑制，在一定剂量范围内呈剂量依赖性。高剂量补气化痰方能显著减轻经OXLDL对血管内皮细胞生长的抑制，这一作用可能是通过调控凋亡调节蛋白的作用达到。BCL-2是一种抑制凋亡过程的蛋白,而BAX是一种促进凋亡过程的蛋白[12-13]。补气化痰方可通过上调BCL-2凋亡抑制蛋白及下调BAX凋亡促进蛋白表达来实现对氧化低密度脂蛋白对猪髂动脉血管内皮细胞损伤的抑制作用。

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R543.1

A

1003-5699(2013)06-0612-03

国家中医药管理局重点专科建设项目课题(2011Z059)。

*[通信作者] 赵德强，Tel:13816985971,E-mail:kevingjq@163.com。

2013-01-16)