比较高碘酸-雪夫与双花扁豆凝集素反应标记的小鼠蜕膜自然杀伤细胞

路 欣 许 晴 翁 静

(1.首都医科大学基础医学教学示范中心形态学实验室，北京100069;2.首都医科大学医学实验与测试中心，北京100069;3.首都医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，北京100069)

妊娠过程中，母体通常情况下不排斥带有父源性成分的胚胎，而是“允许”其“种植”并生长发育，对于这一特殊的免疫现象，尽管已有大量的研究，但仍然没有得到肯定的解答。目前认为正常妊娠时，在母体-胚胎接触面上所具有的免疫特殊性，与激素、细胞因子以及免疫调节细胞密切相关［1］。在母体与胚胎直接接触的蜕膜，有大量的免疫相关细胞，其中自然杀伤细胞(natual killer cell，NK)是最为主要的一类细胞。子宫NK细胞类似于仅占外周血中NK细胞总数10%的CD56brightCD16-NK细胞，表现为弱的细胞毒性，其功能的发挥以产生细胞因子来实现［2］。

在人类分泌期的子宫内膜也有NK细胞，但有研究［3-4］显示，非妊娠和妊娠后存在的子宫自然杀伤细胞在表面标志、分泌的活性物质以及可能的功能等很多方面有一定差异，所以以子宫内膜自然杀伤(endometrial NK，eNK)细胞和蜕膜自然杀伤(decidual NK，dNK)细胞分别描述更为科学。在小鼠，dNK细胞于妊娠期出现在子宫，典型的细胞以含有经淀粉酶消化后高碘酸-雪夫(Periodic acid-Schiff)阳性反应颗粒为特征［5］。但是对于无颗粒的不典型dNK细胞，PAS不能很好地显示。有研究［6］显示双花扁豆凝集素(Dolichos Bifows Agglutinin，DBA)可以高选择性地与糖复合物末端的N-乙酰-D-半乳糖胺(N-acetyl-D-galactosamine)结合，在小鼠子宫仅与dNK细胞膜性结构反应，是继PAS法之后又一种标记小鼠dNK细胞的手段。

本文分别采用PAS、DBA以及DBA加PAS双重标记显示dNK细胞，比较不同方法的差异。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

昆明系成年小白鼠，7～10周龄，体质量25 g，由首都医科大学实验动物中心提供［动物许可证号:SCXK(京)2005－0006］。雌雄分笼饲养，饲养环境为自然光照，温度20℃ ～26℃、湿度40% ～70%，自由取食。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。分笼饲养的小鼠每晚5时按雌雄比2:1进行合笼，次日早晨8时检查雌鼠阴道，发现阴栓当日记为妊娠第1天(Gd 1)。

取 Gd 1～3，Gd 4～6，Gd 7～9，Gd 10～13，Gd 14～16，Gd 17～19天小鼠各5只，颈椎脱臼法处死，取出妊娠子宫，Gd 10天以前保留胚胎，之后去除胚胎，但尽量保留胎盘和子宫的相对位置。包埋面取垂直于子宫长轴，邻近胚胎植入部位。取厚度为4μm的连续切片，分别进行常规HE染色、PAS染色和DBA反应。

1.2 方法

1)PAS反应的主要步骤:切片经二甲苯脱蜡，乙醇下行入水;经唾液淀粉酶作用后，入0.5%高碘酸溶液，室温氧化;洗涤后入雪夫试剂，室温避光作用15 min;SO2水浸洗，蒸馏水洗涤;Ehrlich苏木精复染核;经上行乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

2)生物素标记的双花扁豆凝集素(bio-DBA)的组织化学反应的主要步骤:切片经二甲苯脱蜡入水;3%H2O2，去除内源性过氧化物酶;加bio-DBA(Sigma公司)，4℃过夜(阴性对照以PBS液代替bio-DBA);加带有辣根过氧化物酶的卵白素，室温，30 min;二氨基联苯胺显色2～5 min;自来水冲洗终止反应，蒸馏水洗，经上行乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。每一步骤间经PBS充分洗涤。

3)DBA加PAS双重反应:bio-DBA反应如上所述，DBA显色后，入1%高碘酸溶液，其余操作同1.2.1所述。

1.3 结果判断

PAS反应阳性结果表现为紫红色;DBA阳性反应结果呈现棕黄色，细胞数量采用Leica Q500IW型图像分析仪分析，每个样本于40倍物镜下随机取5个不同视野，计数阳性细胞数，取同一妊娠时期每个高倍视野平均阳性数。

2 结果

2.1 小鼠子宫组织学结构

小鼠子宫自腔面向外可见内膜、肌层以及被覆其外的浆膜。在浆膜向子宫系膜延续的部位，形成一个在横断面上呈三角形的区域(即系膜三角区)，该部位主要在妊娠后，特别是在胚胎“种植”后细胞数明显增多，改称谓子宫腺细胞区(图1A)。随着胚胎的“种植”，子宫腔逐渐缩小直至消失。胎盘结构于妊娠第10天基本形成(图1B)。自妊娠第3天起蜕膜中可见一些圆形细胞，胞质染色比较浅，有些细胞的胞质中可见一些细小的颗粒，这种细胞自妊娠第8天起大量出现于子宫腺细胞区(图1C)。

2.2 dNK细胞形态特点、定位及数量变化

HE染色中圆形、胞质染色比较浅的含有颗粒的细胞PAS呈阳性反应，提示其为dNK细胞。典型的dNK细胞直径约20μm，以胞质内含丰富的被染成紫红色的PAS阳性颗粒为特点，而这些细胞在DBA反应时，细胞膜、颗粒膜以及细胞核膜均呈棕黄色(图2)。

利用PAS和DBA标记法，在未孕(动情周期各期)小鼠子宫内膜中未显示出有典型的dNK细胞。DBA标本上，妊娠第3天即可在内膜中发现体积较小，但细胞膜和细胞核膜呈棕黄色的阳性反应细胞，胞质中没有明显颗粒;而连续切片PAS反应标本，相同部位的细胞则未见明显阳性反应(图3)。妊娠第10天以前的标本上，DBA阳性细胞多于PAS阳性细胞。而随着dNK细胞中阳性颗粒的逐渐增多，基蜕膜和子宫腺细胞区中两种标记显示的阳性细胞数相对一致。对高倍视野下2种方法标记的阳性细胞的计数见表1。

DBA反应后再进行PAS反应，即双重标记显示，大部分dNK细胞的胞膜、细胞核膜呈棕黄色，胞质中含有紫红色和棕黄色2种颜色的颗粒;妊娠第8天以后的标本上，可见少量细胞的颗粒仅呈现PAS阳性(图4)。

表1 PAS和DBA标记不同妊娠时间阳性细胞分布计数(平均每高倍视野细胞数)Tab.1 The number of PAS/DBA positive cells at different pregnant time(avery cell count per high power field)

图4 妊娠小鼠子宫，DBA加PAS双重反应Fig.4 Pregnant uteri of mice，PAS/DBA double reactions protocol

3 讨论

DBA高选择性地与N-乙酰-D-半乳糖胺结合，尽管目前还不清楚DBA结合的半乳糖胺的功能意义，但因其仅与dNK细胞膜及颗粒膜结合，而与外周NK细胞以及子宫中其他淋巴细胞不反应，正在成为继PAS反应之后又一种标记小鼠dNK细胞的手段［6-7］。

本实验结果表明PAS和双花扁豆凝集素组织化学法均可以标记典型的dNK细胞。2种标记方法同时应用时dNK细胞的细胞膜、细胞核膜和颗粒膜呈现DBA阳性，而颗粒呈紫红色PAS阳性反应。两种方法存在一些不同:在妊娠早期(Gd3-Gd6)DBA可以显示没有颗粒的dNK细胞，因此计数的DBA阳性细胞数多于PAS染色的阳性细胞数。提示DBA标记在妊娠早期PAS阳性颗粒尚未出现的幼稚dNK细胞。

双重标记的标本上，在妊娠第8天以后可见非常少量的细胞仅表现为PAS阳性，而DBA为阴性，这与早期DBA阳性而PAS染色阴性的结果正好相反。我们推测这种差异可能是由于dNK细胞起源差异。目前关于dNK细胞的起源还存在争议:有人认为［8-9］dNK细胞可能源自淋巴器官以及外周血中的NK细胞;有学者［10］则提出dNK细胞源于子宫内膜基底层的前体细胞;还有学者［11］提出 dNK细胞可能是由eNK细胞增生并转化而来。目前尚不能够确定dNK细胞为单一来源。

总之，小鼠dNK细胞可以用PAS和DBA来显示，以含有PAS阳性颗粒为特点。DBA因与dNK细胞的细胞膜、核膜及颗粒膜特异结合，而成为一种新的dNK细胞标志物，特别适用于妊娠早期。

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