水稻Xa7基因抗白叶枯病应答中的活性氧代谢分析*

马伯军, 郑茜茜, 张萍华, 胡娜娜, 陈析丰

(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)

水稻Xa7基因抗白叶枯病应答中的活性氧代谢分析*

马伯军, 郑茜茜, 张萍华, 胡娜娜, 陈析丰

(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)

白叶枯病是由革兰氏阴性黄单孢菌水稻变种(Xanthomonasoryzaepv.Oryzae，Xoo)所引起的一种世界性水稻细菌病害.水稻Xa7基因是一个具有广谱抗性的显性抗白叶枯病基因.通过对水稻抗病品种IRBB7(含Xa7)和感病对照IR24接种白叶枯菌PXO86，发现:在叶片的病原菌侵染部位，IRBB7比IR24的活性氧(H2O2和O2-)积累更快且含量更高;与活性氧代谢相关的酶,如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶和过氧化物酶的活性也更高.推测活性氧的代谢调节可能在Xa7基因介导的抗病反应中起作用.

水稻；抗白叶枯病；Xa7基因；活性氧

活性氧(reactive oxygen species，ROS)的迅速积累(又称氧迸发)是植物抗病应答的早期特征之一[1].活性氧在植物抗病机制中起着重要作用，除了能直接抑制病原菌的生长，还是激活抗病应答的一种信号分子[2].但是，生物或非生物逆境胁迫产生的活性氧往往对植物细胞有毒害作用，所以植物具有一套清除活性氧的酶系统[3]，如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(peroxidase，POD)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)和过氧化氢酶(catalase，CAT)等.植物必须分清活性氧产生的信号来源，通过调节各种活性氧清除酶的活性，维持细胞内活性氧的动态平衡，在发挥活性氧生理功能的同时保护细胞不受毒害.

白叶枯病是水稻的一种严重细菌性病害.有关白叶枯病菌对水稻活性氧代谢影响的研究已有很多报道[4-9]，但结果却不尽一致，表明水稻抗病中活性氧的调节机制可能比较复杂.水稻Xa7基因是一个高抗、广谱、持久的抗白叶枯病基因[10-13].但是，至今Xa7基因仍未被克隆，其抗病机制也不清楚.本研究对含Xa7基因的水稻和感病对照品种接种白叶枯病菌，测定了不同时间段其活性氧含量及其清除酶活性，探讨了活性氧在水稻Xa7基因抗病应答中的作用.

1 材料与方法

1.1水稻培养及白叶枯病接种

2011年5月中旬，在金华试验田播种抗病籼稻IRBB7(OryzaSativaL. ssp.indica)及其感病近等基因系IR24.待成株期，用剪叶法[14]接种白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.Oryzae)菲律宾小种PXO86，以清水接种作对照.接种后0，6，12，24和48 h取距离剪口3～5 cm长的叶片组织，贮存于-80 ℃备用.

接种体制备方法：将菌株接种在PDA培养基(马铃薯300 g/L，葡萄糖30 g/L，琼脂15 g/L)上，于28 ℃恒温培养箱中培养3～4 d，用蒸馏水从培养基上洗下菌落，并稀释成9×108cfu/mL的细菌悬浮液.

1.2H2O2的提取和含量测定

H2O2的提取和含量测定参照Patterson等[15]的方法，并稍作改进：取0.7 g叶片以冷丙酮研磨成匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液用冷丙酮定容至10 mL.取1 mL提取液加0.1 mL50 g/L硫酸钛溶液和0.2 mL浓氨水，3 000 r/min离心10 min，弃上清，然后用冰丙酮反复洗涤3～5次，直至除去植物色素，再向沉淀中加5 mL2 mol/L硫酸溶液，待沉淀完全溶解后，于415 nm波长下比色.按同样程序制备H2O2标准曲线，标准H2O2溶液用KMnO4法标定.

1.3O2-的提取和含量测定

O2-的提取和含量测定采用羟胺氧化法.取待测植物样品0.7 g于研钵中，加5 mL 65 mmol/L磷酸缓冲溶液(pH 7.8)研磨成匀浆，10 000 r/min离心10 min，取上清液用上述磷酸缓冲溶液定容至10 mL.取提取液2 mL，加磷酸缓冲溶液1.5 mL和10 mmol/L盐酸羟胺溶液0.5 mL，混合后25 ℃恒温水浴保温20 min.从上述试管中取反应液2 mL，加2 mL 17 mmol/L对氨基苯磺酸溶液和2 mL 7 mmol/Lα-萘胺溶液，30 ℃恒温水浴中反应30 min，于530 nm波长下比色.按同样程序制备O2-标准曲线.

1.4活性氧代谢相关酶的制备与活性测定

酶液制备参照Sato等[16]方法.取0.1 g叶片用50 mmol/L磷酸钠缓冲溶液(pH 7.0)研磨，匀浆于4 ℃ 10 000 r/min离心20 min，上清液立即用于酶活性分析.

SOD活性测定参照文献[17]的方法；POD活性测定参照文献[18]的方法；CAT活性测定参照文献[17]的方法；APX活性测定参照文献[19]的方法.蛋白质含量测定参照文献[20]的考马斯亮蓝法进行.

以上测定所用植物样品均取自至少4株不同的单株，每一处理测定3个样品，3次生物性重复.

2 结果与分析

将IRBB7(含Xa7)和IR24(感病对照)在试验田内播种，长至成株期时接种白叶枯病菌PXO86，以清水接种作对照.接种后15 d测定病斑长度，IRBB7的病斑长度均小于2 cm，而IR24的病斑长度均大于15 cm，表现出明显的抗感差异，表明Xa7基因启动了抗病应答反应.为了研究Xa7介导的抗性与活性氧代谢间的关系，本实验对接种后0，6，12，24和48 h的叶片进行了分析，测定了活性氧H2O2和O2-的含量及其相关代谢酶，如SOD，CAT，APX和POD的活性变化.

2.1O2-含量变化

IRBB7和IR24叶片接种白叶枯病菌PXO86后，叶片内O2-含量上升，于6 h达到最大值，而后有所下降(见图1(a)).相对于IR24接菌叶片，IRBB7接菌叶片内O2-积累快且含量高.IRBB7接菌后叶片中O2-含量最大值(6 h时)比IR24接菌叶片的最大值(6 h时)高出25.5%.与接水相比，IRBB7接菌叶片中O2-含量最大值(6 h时)比同期接水叶片的最大值(6 h时)高23.5%；而IR24接菌叶片中O2-含量最大值(6 h时)比同期接水叶片的最大值(6 h时)只高出4.7%.

2.2H2O2含量变化

IRBB7和IR24叶片接种白叶枯病菌PXO86后，叶片内H2O2含量上升，于12 h达到最大值，而后有所下降(见图1(b)).相对于IR24接菌叶片，IRBB7叶片内H2O2积累快且含量高.在6 h这一时间点上，IRBB7接菌后叶片中H2O2含量比IR24接菌后叶片中H2O2含量高40.9%.IRBB7接菌叶片中H2O2含量比同期接水叶片中H2O2含量高出59.6%；而IR24接菌叶片中H2O2含量比同期接水叶片中H2O2含量只高1.1%.

R-P2：IRBB7接种PXO86；R-H2O：IRBB7接种清水；S-P2：IR24接种PXO86；S-H2O：IR24接种清水图1 接种白叶枯病菌后水稻叶片中活性氧含量的变化

2.3SOD活性变化

IRBB7和IR24叶片接种白叶枯病菌PXO86后，叶片中SOD活性先呈上升趋势，24 h达到最大值，而后下降(见图2(a)).IRBB7接菌后叶片中SOD活性始终高于IR24接菌后，最高值(24 h时)比IR24接菌后的最高值(24 h时)高出25.6%.与接水相比，IRBB7接菌叶片中SOD活性最大值(24 h时)比同期接水叶片的最高值(24 h时)高44.1%；而IR24接菌叶片中SOD活性最高值(24 h时)比同期接水叶片的最高值(24 h时)只高4.6%.

2.4APX活性变化

IRBB7和IR24叶片接种白叶枯病菌PXO86后，叶片中APX活性在12 h后呈下降趋势，24 h达到最小值，而后上升，48 h达到最大值(见图2(b)).IRBB7接菌叶片中APX活性最高值(48 h时)比IR24接菌叶片的最高值(48 h时)高出43.6%.与接水相比，IRBB7接菌叶片中APX活性最大值(48 h时)比同期接水叶片的最高值(12 h时)高出54.3%，而IR24接菌叶片内APX活性最高值(48 h时)比同期接水叶片的最高值(48 h时)只高出14.9%.

2.5CAT活性变化

IRBB7和IR24叶片接种白叶枯病菌PXO86后，IRBB7叶片中CAT活性起初有所上升，而后在6～12 h有所回落，在12～24 h又有所回升,并在24 h达到最大值，之后在24～48 h又有所下降;IR24叶片中CAT活性起初有所下降，而后在6～12 h有所回升，于12 h达到最大值，在12～48 h又有所下降(见图2(c)).IRBB7接菌叶片内CAT活性始终高于IR24叶片的CAT活性，其最高值(24 h时)高于IR24接菌叶片最高值(12 h时)64.0%.与清水接种相比，IRBB7接菌叶片中CAT活性最高值(24 h时)高于同期清水接种叶片最高值(6 h时)10.0%，IR24接菌叶片内CAT活性最高值(12 h时)低于同期接种清水叶片最高值(6 h时)33.2%.就6 h这一时间点而言，IRBB7接菌叶片CAT活性高于IR24接菌叶片CAT活性96.9%;与接水相比，IRBB7接菌叶片中CAT活性比同期接水叶片只高出6.3%，IR24接菌叶片内CAT活性低于同期接水叶片的65.5%.

R-P2：IRBB7接种PXO86；R-H2O：IRBB7接种清水；S-P2：IR24接种PXO86；S-H2O：IR24接种清水图2 接种白叶枯病菌后水稻叶片中活性氧代谢相关酶活性的变化

2.6POD活性变化

IRBB7和IR24叶片接种白叶枯病菌PXO86后，IRBB7叶片中POD活性呈上升趋势，48 h达到最大值;IR24叶片中POD活性在0～6 h有所下降，而后呈上升趋势，48 h达到最大值(见图2(d)).IRBB7接菌后叶片内POD活性始终高于IR24接菌叶片中POD活性，其最高值(48 h时)高于IR24接菌叶片最高值(24 h时)61.6%.与接水相比，IRBB7接菌叶片中POD活性最高值(48 h时)高于同期接水叶片最高值(12 h时)35.0%，而IR24接菌叶片内POD活性最高值(24 h时)比同期接水叶片最高值(24 h时)低1.3%.

3 讨 论

植物细胞中H2O2和O2-是2种主要的活性氧.在生物体内活性氧广泛存在并具有多种生理功能[21]，可直接抵御微生物、参与细胞壁木质化及富含羟脯酸的糖蛋白的交联.此外，活性氧还可作为信号分子调控抗病相关基因的表达，激活超敏反应(hypersensitive response，HR)[22].本研究发现，接种白叶枯病菌PXO86后,IRBB7叶片中H2O2和O2-含量显著高于IR24叶片.这一结果与文献[4-9]的研究结果一致.推测Xa7介导的抗病性可能与植株体内活性氧的快速积累有关.

超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和过氧化氢酶(CAT)是植物细胞中主要的活性氧清除酶.SOD催化O2-生成H2O2，而 CAT，APX和 POD 则催化H2O2还原成H2O.在病原菌侵染后引起的不亲和反应中，SOD，APX和POD的活性一般表现为上升，且高于亲和反应；CAT活性则表现为下降，且低于亲和反应[23-25].本研究结果显示，水稻感染白叶枯病菌后，IRBB7叶片中SOD，CAT，APX和POD的活性均高于感病品种IR24叶片中这些酶的活性.这些活性氧清除酶的活性大幅度提高，可能有助于降低生物胁迫产生的活性氧毒害，提高水稻对白叶枯病菌的抗性.

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(责任编辑 薛 荣)

MetabolismofreactiveoxygenspeciesinresistantresponseofriceXa7genetobacterialblight

MA Bojun, ZHENG Xixi, Zhang Pinghua, HU Na′na, CHEN Xifeng

(CollegeofChemistryandLifeScience,ZhejiangNormalUniversity,JinhuaZhejiang321004,China)

Bacterial blight (BB), caused byXanthomonasoryzaepv.Oryzae, is one of the most serious worldwide disease of rice.Xa7 is a broadly dominant resistance gene directed against BB. The resistant rice cultivar IRBB7 (withXa7) and susceptible control IR24 were inoculated with strain PXO86 of BB. Comparison to the IR24, the leaves of IRBB7 accumulated reactive oxygen species (ROS; H2O2and O2-) faster and higher, the activity of active oxygen metabolism-related enzymes (SOD, CAT, APX and POD) of IRBB7 was higher in the infect site. It was suggested that the regulation of ROS metabolism might be helpful for theXa7-mediated disease resistance response.

rice; resistance of bacterial blight;Xa7 gene; reactive oxygen species

Q943;S432.1

A

1001-5051(2013)01-0001-05

2012-9-17

国家重大科技专项(2011ZX08009-003-001)；国家自然科学基金资助项目(31171519；31101130)；浙江省自然科学基金资助项目(Y3110234；Y3100531)；浙江省重点科技创新团队项目(2010R50024)；浙江省公益性技术应用研究计划项目(2011C22005)

马伯军(1965-),男，浙江嵊州人，教授,博士.研究方向：植物遗传学.