Ghrelin对脑缺血再灌注大鼠脑水肿和水通道蛋白4表达的影响*

贾增强， 王 来， 刘丽冰， 曾现伟△， 祝世功△

(1北京大学医学部生理学与病理生理学系， 北京 100191； 2潍坊医学院， 山东 潍坊 261053)

Ghrelin对脑缺血再灌注大鼠脑水肿和水通道蛋白4表达的影响*

贾增强1,2， 王 来1， 刘丽冰2， 曾现伟2△， 祝世功1△

(1北京大学医学部生理学与病理生理学系， 北京 100191；2潍坊医学院， 山东 潍坊 261053)

目的探讨ghrelin对脑缺血再灌注大鼠脑水肿、血脑屏障通透性及水通道蛋白4(AQP4)表达的影响。方法成年SD雄性大鼠随机分为3组:sham组、大脑中动脉阻塞(MCAO)组和ghrelin处理组。采用线栓法复制MCAO模型(缺血2 h,再灌注22 h)。Ghrelin组大鼠于再灌开始时经股静脉注射ghrelin 10 nmol/kg。TTC染色观察脑梗死体积，神经功能评分判断脑功能障碍程度，分别以体积计算和干湿重法检测脑肿胀程度和脑含水量的变化，收集脑血管外伊文思蓝(EB)来评估血脑屏障的破坏程度，免疫组化和Western blotting检测AQP4的表达变化。结果与MCAO组比较，ghrelin处理组的脑梗死体积较小(P<0.01)，神经功能评分较低(P<0.01)，脑组织中的EB渗出量较少(P<0.01)。Ghrelin处理组大鼠的脑肿胀体积、脑含水量和AQP4表达明显低于MCAO组(P<0.05)。结论Ghrelin减轻大鼠脑缺血/再灌注损伤，减轻脑水肿和血脑屏障的破坏，抑制脑组织中AQP4的表达。AQP4在ghrelin的脑保护机制中可能发挥重要作用。

缺血再灌注损伤； Ghrelin； 脑水肿； 水通道蛋白4； 血脑屏障

脑缺血缺氧是临床上脑卒中患者致死致残的主要病因，其不仅引起缺血区域神经细胞的凋亡或坏死，还伴随血脑屏障的破坏和脑水肿等一系列病理变化，脑水肿可导致颅内压升高，继而挤压非缺血区，影响其功能，还会促进脑疝形成，严重威胁病人的生命。血脑屏障的破坏也是脑缺血后脑水肿形成的促进因素。水通道蛋白在调节细胞内外水平衡和跨膜流动过程中发挥重要作用。目前已知有13个亚型，其中水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)在脑组织表达最高，主要分布于脑微血管周围星形胶质细胞的终足和室管膜细胞上。具有调节脑内水流动的功能[1]。局灶性脑缺血再灌注实验表明，AQP4基因敲除小鼠脑水肿的程度比野生小鼠明显降低，神经功能障碍程度也明显减轻[2]。临床脑梗死病人脑组织中AQP4的表达增多，并与脑缺血后脑水肿的严重程度具有相关性[3]。以上研究均说明AQP4参与脑缺血再灌注引起的脑水肿形成过程。

Ghrelin 是由28个氨基酸组成的一种脑肠肽。前期研究表明，ghrelin可降低脑缺血再灌后的脑梗死体积[4]，具有神经保护作用。但是，ghrelin 抗脑缺血再灌注损伤作用与AQP4的关系，以及对脑内含水量、水肿体积和血脑屏障通透性的影响尚未见报道。

材 料 和 方 法

1动物分组及脑缺血再灌注模型复制

采用雄性、清洁级SD大鼠(由北京大学医学部实验动物中心提供)，体重(290±10)g,单笼饲养，自由进食及饮水，室温维持在20～25℃。 将45只大鼠，随机分为sham组、大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)组和ghrelin处理组(ghrelin组)，每组15只。参照以前报道,采用线栓法复制大鼠MCAO缺血再灌注模型[5]，MCAO组与ghrelin组大鼠脑缺血2 h后,撤除栓线进行再灌注22 h。Sham组的手术过程与MCAO组和ghrelin组相同，但栓线不插入大脑中动脉区域。Ghrelin组于再灌开始时通过股静脉注射ghrelin 10 nmol/kg(Phoenix)，其它过程与缺血再灌注组相同。各组动物手术后24 h在水合氯醛麻醉下处死，分别进行脑梗死体积测量、脑含水量测定、伊文思蓝(Evans blue,EB)渗透量检测、AQP4表达分布和AQP4蛋白电泳。每项需3只大鼠。

2神经功能评分

参照Longa评分标准对大鼠进行神经功能评分[6]。无神经病学征象为0分；竖毛，轻度运动低下为0.5分；前肢屈曲，有运动障碍为1分；行动不协调，屈曲姿势，旋转运动为2分；偏瘫，不能站立行走为3分；痉挛，昏睡为4分；死亡为5分。

3脑梗死体积观察

处死动物后，取脑置于-20 ℃，冰冻5 min，然后，将脑组织由前向后冠状切成2 mm组织片，并浸泡于0.5% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)磷酸缓冲液中，37 ℃避光孵育15～20 min，最后用4%多聚甲醛溶液固定。脑梗死体积按如下公式计算：梗死百分比(%)=(对侧体积-缺血侧未梗死体积)/对侧体积 ×100%。

4脑水肿及含水量测定

处死动物，取脑，分别称量缺血脑半球的湿重，然后将脑组织置于80 ℃干燥烤箱中烘烤24 h。将脑组织取出后立即称量缺血脑半球的干重，然后按照以下公式进行计算脑含水量和脑肿胀程度。脑含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。脑肿胀体积百分比(%)=(缺血侧体积-对侧体积)/对侧体积×100%。

5伊文思蓝渗透量检测

各组大鼠在麻醉处死前2 h股静脉注射2% EB(4 mL/kg)。再灌注22 h后，10%水合氯醛麻醉大鼠, 打开胸腔经左心室插管灌注生理盐水快速冲洗血管，断头取脑，将缺血侧脑半球分离称重，添加4 mL二甲基甲酰胺，50 ℃水浴30 min, 组织匀浆，12 500 r/min 离心30 min，取上清，在635 nm波长测吸光度，以计算脑组织内EB含量(μg/g)。

6免疫组织化学法检测AQP4的表达和分布

各组大鼠, 10%水合氯醛过量麻醉处死, 4%多聚甲醛灌流固定后取脑，常规制作10 μm冰冻切片，5% BSA室温封闭30 mm，加兔抗AQP4抗体(1∶400, Santa Cruz)，4 ℃过夜，次日加HRP标记的山羊抗兔Ⅱ抗，DAB显色。在光镜下观察。

7Westernblotting法测定AQP4表达

各组大鼠取脑后，加入RIPA裂解液(碧云天公司产品)，电动匀浆器匀浆，12 000 r/min，4 ℃ 离心30 min，取上清，BCA法(Thermo Fisher Scientific)定量蛋白浓度，10%聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白，湿法转膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入兔抗AQP4抗体(Santa Cruz)和β-actin抗体(CST)，4 ℃过夜，加HRP标记的Ⅱ抗(中杉金桥公司)，ECL试剂盒(Millipore)显色检测蛋白条带，以Quantity One软件进行图像灰度值分析，以β-actin灰度值作为内参照,校正各组AQP4的吸光度值。

8统计学处理

采用GraphPad Prism软件处理数据和制作图表，数据以均数±标准差(mean±SD)表示。组间均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1Ghrelin对脑梗死体积及神经功能评分的影响

`TTC染色和梗死体积计算结果显示，MCAO组出现较大的梗死灶(46.48%±3.12%)，ghrelin处理组的梗死灶(11.54%±2.98%)显著小于MCAO组，差异有统计学意义(P<0.01),见图1A、B。神经功能评分表明，MCAO组分数(2.25±0.25)明显高于ghrelin组(1.25±0.25)，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1C。

Figure 1. Effects of ghrelin on the infarct volume and the neurological function after cerebral ischemia/reperfusion. A: TTC staining; B: infarct volume; C: neurological score.Mean±SD.n=3.#P<0.05,##P<0.01vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsMCAO group.

图1Ghrelin对缺血再灌注后脑梗死体积和神经功能的影响

2Ghrelin对脑肿胀体积和脑含水量的影响

缺血2 h再灌注22 h后，MCAO组脑肿胀体积百分比(21.54%±2.98%)高于ghrelin组 (7.26%±3.08%)，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2A。脑含水量测定结果表明，MCAO组脑含水量(76.63%±0.58%)大于sham组(66.83%±0.29%) (P<0.01)，ghrelin组脑含水量(71.58%±0.30%)低于MCAO组(P<0.05)，见图2B。

Figure 2. Effects of ghrelin on the brain swelling and water content after cerebral ischemia/reperfusion. A: volume of brain swelling; B: water content.Mean±SD.n=3.##P<0.01vssham group;*P<0.05vsMCAO group.

图2Ghrelin对缺血再灌注后脑肿胀程度和脑含水量的影响

3Ghrelin对伊文斯蓝渗出量影响

血脑屏障破坏后，EB通过脑血管渗出到脑组织内的含量增加，结果显示，MCAO组脑组织内EB的渗出量(27.33±2.03)明显高于sham组(5.59±0.76)，差异显著(P<0.01)。Ghrelin 组脑组织内EB的渗出量(11.02±0.50)明显低于MCAO组(P<0.01)，见图3。

4Ghrelin对脑组织AQP4表达的影响

4.1Western blotting 如图4所示，sham组大鼠脑组织中可见AQP4表达；MCAO组大鼠脑组织中AQP4的表达水平明显高于sham组,差异有统计学意义(P<0.05);ghrelin组大鼠脑组织中AQP4的表达明显低于MCAO组，差异有统计学意义(P<0.05)。

4.2免疫组化染色 免疫组化结果表明,sham组大鼠脑皮层表达AQP4(图5A)；MCAO组大鼠脑皮层高表达AQP4(图5B);ghrelin组大鼠脑皮层的AQP4表达与sham组相近(图5C)。其它脑区也有不同程度的AQP4表达(结果未显示)。

Figure 3. Effect of ghrelin on Evans blue exudation content after cerebral ischemia/reperfusion. Mean±SD.n=3.##P<0.01vssham group;**P<0.01vsMCAO group.

图3Ghrelin对缺血再灌注后EB渗出的影响

Figure 4. Effect of ghrelin on the expression of AQP4 after cerebral ischemia/reperfusion detected by Western blotting analysis.Mean±SD.n=3.#P<0.05vssham group;*P<0.05vsMCAO group.

图4Westernblotting法检测ghrelin对脑缺血再灌注大鼠脑组织AQP4表达的影响

讨 论

脑水肿是脑缺血再灌后损伤的重要病理变化。脑缺血早期的脑水肿属于细胞毒性脑水肿，主要是胞内水钠潴留引起细胞体积的增加，随着时间推移，逐渐转变为血管源性脑水肿。此时，微血管通透性增高，脑组织细胞间液胶体渗透压升高，水由血管内转移至脑实质，引起脑组织肿胀。近些年来研究发现，AQP4具有调节脑水跨膜运动和平衡的作用，参与细胞毒性脑水肿和血管源性脑水肿的形成[6]。基因敲除鼠的研究资料表明，在脑缺血再灌注的AQP4-/-小鼠，其神经功能障碍和脑水肿程度都比野生型小鼠轻[2]，说明脑组织中AQP4的表达水平与脑缺血后脑水肿的形成密切相关。因此，AQP4的调节及与脑缺血后脑水肿形成关系受到高度关注。

Figure 5. Effect of ghrelin on the expression of AQP4 in rat cortex after cerebral ischemia/reperfusion detected by immunohistochemistry analysis (×200; inside,×400). A: sham group; B: MCAO group; C: ghrelin group.

图5免疫组化法检测ghrelin对缺血再灌注大鼠脑皮层AQP4表达的影响

Ghrelin是近些年发现的一种脑肠肽，不仅参与饮食、血压等生理功能的调节[7-8]，而且具有抗损伤和细胞保护作用[9-11]。本实验室的前期工作也发现，ghrelin通过上调Bcl-2和HSP70的表达降低脑缺血再灌后引起的脑组织损伤[12]。Lopez等[13]利用脑创伤模型研究发现，外源性ghrelin可以减轻血脑屏障的破坏和脑水肿，并与降低脑血管周围AQP4表达相关。但有关ghrelin与缺血后脑水肿及AQP4表达之间关系尚未见研究报道。本实验结果发现，大鼠脑缺血后开始再灌注时给予ghrelin，不但可显著降低脑梗死体积和神经功能障碍，而且能显著减轻脑水肿和缺血再灌注引起的血脑屏障破坏，提示ghrelin 可从多个环节发挥神经保护作用。不仅在血管源性水肿阶段发挥防止水分向组织渗透的功能，而且对于维持血脑屏障通透性的稳定具有一定作用。脑水肿和血脑屏障破坏的减轻可减缓因脑缺血再灌注造成的颅内压升高，避免脑组织的二次损伤，对于减轻并发症，降低死亡率具有重要意义。AQP4是脑组织中表达最高的水通道蛋白，主要分布于星形胶质细胞和室管膜细胞上，参与脑水转运。实验结果表明， MCAO大鼠脑中AQP4高表达，而在ghrelin处理组大鼠脑中低表达，说明ghrelin对于AQP4的表达具有抑制作用。这一作用很可能是ghrelin抗脑缺血再灌注损伤的重要机制环节，值得深入研究。

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Effectsofghrelinonbrainedemaandaquaporin4expressionaftercerebralischemia/reperfusioninrats

JIA Zeng-qiang1,2, WANG Lai1, LIU Li-bing2, ZENG Xian-wei2, ZHU Shi-gong1

(1DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,PekingUniversityHealthScienceCenter,Beijing100191,China;2WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China.E-mail:sgzhu@bjmu.edu.cn;zengxwei@163.com)

AIM: To explore the effects of ghrelin on the brain edema, the permeability of blood-brain barrier (BBB) and the expression of aquaporin 4 (AQP4) after cerebral ischemia/reperfusion in rats.METHODSAdult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group, middle cerebral artery occlusion (MCAO) group and ghrelin treatment group. The MCAO model was made with nylon thread for 2 h of occlusion following 22 h of reperfusion. Ghrelin at a dose of 10 nmol/kg was injected via femoral vein at the beginning of reperfusion. The cerebral infarct volume was measured by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining. Brain functional deficits were evaluated by determining the neurological scores. The changes of brain swelling and water content were analyzed through volume calculation and dry/wet weight measurement. The permeability of BBB was detected by collecting extravascular Evans blue (EB) in the brain cortex. The changes of AQP4 expression were assessed by the methods of immunohistochemistry and Western blotting.RESULTSCompared with MCAO group, the rats in ghrelin treatment group had smaller brain infarct volume, lower EB exudation content and neurological scores. The percentage of brain swelling, water content and AQP4 expression were lower in ghrelin treatment group than those in MCAO group.CONCLUSIONGhrelin reduces the injury of cerebral ischemia/reperfusion, and lightens the brain edema and BBB damage in rats. Ghrelin also inhibits the expression of AQP4 in brain tissue.

Ischemia-reperfusion injury; Ghrelin; Brain edema; Aguaporin 4; Blood-brain barrier

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.05.017

1000- 4718(2013)05- 0867- 05

2013- 03- 08

2013- 03- 21

国家自然科学基金资助项目(No.30871034; No.81171081)

△通迅作者 曾现伟 Tel: 053-68068830; E-mail: zengxwei@163.com; 祝世功 Tel: 010-82801477; E-mail: sgzhu@bjmu.edu.cn