matK序列作为DNA条形码在苍耳属中的应用

胡伟毅， 邵套喜

(1.连云港出入境检验检疫局，江苏连云港 222042； 2.江苏省赣榆县塔山镇农业技术服务中心，江苏连云港 222123)

matK序列作为DNA条形码在苍耳属中的应用

胡伟毅1， 邵套喜2

(1.连云港出入境检验检疫局，江苏连云港 222042； 2.江苏省赣榆县塔山镇农业技术服务中心，江苏连云港 222123)

以matK序列作为DNA条形码，对从国外截获的7种苍耳属植物进行物种区分鉴定研究，采用DNeasy® Plant Mini Kit试剂盒进行总DNA的提取，应用通用引物对其matK基因进行扩增，测序得到7种苍耳属植物的matK序列，利用MEGA 5.1软件对这7种苍耳属植物的matK序列进行比对和分析并构建系统树，结果显示：matK序列能从基因位点层面对苍耳属植物进行区分鉴定。

matK序列；DNA条形码；苍耳属

苍耳属(Xanthium)植物为农田中的主要杂草，且可黏附于动物毛皮上，从而降低毛皮的品质，影响动物的健康，因此在2006年发布的农业部与国家质量监督检验检疫总局共同制定的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中，将所有的苍耳属(非中国种)植物都列为检疫性有害生物，防止其进入我国，危害我国农业生态安全。近年来，随着我国检验检疫鉴定技术的提高，许多苍耳属(非中国种)植物都被鉴定到种，但是苍耳属植物的形态鉴定手段对实验室鉴定经验有着较高的要求，而且苍耳属的果实在粮谷的长期运输中难免会受到磨损，因此检验检疫工作的一线工作人员有必要寻求新技术、新方法的支持。

植物DNA条形码技术是针对植物基因组中的特定基因进行片段扩增、测序并发现其碱基变化规律的技术手段，其概念由加拿大科学家Paul Hebert于2003年正式提出[1]，该技术在动物的COI基因中应用较为成熟[2-4]，但由于COI基因在植物中变化保守，不能起到很好的区分作用，使得植物DNA条形码技术的研究重点仍在通用基因片段的应用、筛选、搭配上[5]。尽管如此，植物DNA条形码技术仍在保护濒危物种、药品食品监督、中草药资源鉴定及生态学调查等诸多领域中起到了突破性的作用，发挥了以前形态学研究所无法产生的威力[6-8]。matK序列是编码成熟酶K蛋白的基因，是国际生物条形码联盟(CBOL)推荐的植物DNA条形码核心序列[9]。本试验以2012年连云港口岸截获的7种苍耳属植物为研究对象，探讨其matK序列变化规律。

1 材料与方法

1.1 试验材料

7种苍耳属植物：北美苍耳(Xanthiumchinese)、苍耳(Xanthiumsibiricum)、刺苍耳(Xanthiumspinosum)、西方苍耳(Xanthiumoccidentale)、巴西苍耳(Xanthiumbrasilicum)、美丽苍耳(Xanthiumspeciosum)、宾州苍耳(Xanthiumpensylvanicum)。以上外来苍耳均为2012年在进口大豆中截获，并由中国检验检疫科学院鉴定的样本；DNeasy® Plant Mini Kit、2×Taqmaster mix、琼脂糖、Golden View Ⅰ(GV Ⅰ)等试剂耗材。

matK引物[10]：matKf：5′-C G A T C T A T T C A T T C A A T A T T T C-3′；matKr：5′-T C T A G C A C A C G A A A G T C G A A G T-3′。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取 采用DNeasy® Plant Mini Kit试剂盒法提取DNA，按照说明书逐步操作，可得到200 μL DNA样品，-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 PCR反应体系 PCR反应使用中美泰和公司2×Taq master mix进行扩增，反应采用25μL体系：DNA模板，3μL；引物1，1μL；引物2，1μL；2×Taq master mix，12.5 μL；ddH2O，7.5μL。

1.2.3 PCR扩增反应条件 95 ℃，4 min；94 ℃、45 s，52 ℃、1.5 min，72 ℃、1.5 min，35个循环；72 ℃、10 min；4 ℃保存。

1.2.4 琼脂糖凝胶置备 称取1.5 g 琼脂糖 G-10于锥形瓶中，分别加入100 mL ddH2O、2 mL 50×TAE buffer，高火微波 4 min，将锥形瓶置于75 ℃水浴中5 min；再加入 10 μL GV Ⅰ，摇匀后静置10 min，倒入凝胶模具中，放置 30 min 后使用。

1.2.5 电泳 取4 μL PCR产物点样电泳，100 V，45 min。将凝胶放入凝胶成像系统拍照，得到电泳结果图(图1)。与Marker对比可知，改扩增产物大小接近 750 bp，符合预期。

1.2.6 测序及拼接 将PCR产物送往中美泰和生物技术(北京)有限公司进行双向测序，将测序结果用CodenCode Aligner软件对其剪切和拼接，得到完整序列。

2 结果分析

2.1 BLAST检测

登陆NCBI，将拼接后的序列进行BLAST检测，证明7种苍耳属植物的matK序列扩增及测序成功。

2.2 ClustalW校对

利用MEGA5.1软件[11]对7种苍耳属植物进行ClustalW校对，校对后的序列继续用MEGA5.1进行分子进化遗传分析。

2.3 碱基构成分析

从表1可以看出，苍耳属植物matK序列的T、A、G、C碱基的变化范围依次减小，分别为8.6%、7.9%、1.5%、0.3%。其中T碱基含量最高的是刺苍耳，为37.8%，最低的是西方苍耳，为29.2%；A碱基含量最高的是西方苍耳，为37.2%，最低的是为巴西苍耳、北美苍耳，均为29.3%；G碱基含量最高的是苍耳，为17.5%，最低的是宾州苍耳，为16.0%；C碱基含量最高的是宾州苍耳，为16.9%，最低的是西方苍耳、苍耳，均为16.6%。

2.4 基因位点分析

由MEGA5.1测算可知，苍耳属植物matK序列共有927个位点，其中保守位点有422个、变异位点505个，变异位点中单突变位点有19个(表2)。

2.5 遗传距离分析

利用MEGA5.1软件，采用Tajima-Nei模型计算遗传距离，得到表3，可以看出，苍耳属植物matK序列的遗传距离最高值为2.553 3，为苍耳与美丽苍耳的遗传距离；最小值为0.000 0，为巴西苍耳与北美苍耳的距离。这说明虽然巴西苍耳与北美苍耳单从序列上看，于33、904、916位点存在有位点的插入缺失差异，但在Tajima-Nei模型中被忽略不计，所从遗传距离上无法区分。

2.6 系统进化发育树

利用MEGA5.1软件，采用Neighbor-Joining方法构建系统发育树(图2)，可以看出：苍耳、西方苍耳被分为一支；宾州苍耳被分为一支；巴西苍耳、北美苍耳、刺苍耳、美丽苍耳被分为一支；对其进行bootstrap检验，其分组支持率为100%，说明这3支苍耳属植物在系统进化发育中是相互独立的。巴西苍耳、北美苍耳、刺苍耳、美丽苍耳这一支又被划分为不同级别的分支，但是其bootstrap检验支持率最高仅为47%，说明从植物matK序列进化层面讲，这4种苍耳属植物在苍耳属系统进化发育中的独立性相对较弱。

表1 苍耳属植物matK序列碱基构成Table 1 The matK sequence base composition of Xanthium plants

表2 苍耳属植物matK序列单突变位点Table 2 The matK sequence single mutations of Xanthium plants

表3 苍耳属植物matK序列遗传距离Table 3 The matK sequence genetic distance of Xanthium plant

3 讨论

外来杂草对我国产生了严重危害[12]，对外来杂草种子的鉴定工作一直以来都是进境粮谷检验检疫工作的重点。但是由于杂草种子在粮谷的长期运输中难免会受到磨损，从而不具备鉴定到物种的足够信息，而进口货物的检验检疫周期又有一定的时间要求，这就使得外来杂草种子的鉴定工作成为粮谷检验检疫工作的难点。解决这个问题亟需加强检验检疫系统与各个科研院所的合作，引进新的科技手段。本试验就是将DNA条形码鉴定手段应用到来自世界各地的苍耳属植物中，从试验结果来看，matK序列能从基因位点层面对苍耳属植物进行区分，但是也存在有以下不足：(1)巴西苍耳与北美苍耳在matK序列仅存在基因位点插入缺失的差异；(2)matK序列对巴西苍耳、北美苍耳、刺苍耳、美丽苍耳这一系统发育支系的继续分化没有提供较高的支持值。在植物DNA条形码的研究中，trnH-psbA、rbcL、ITS、ITS2等基因序列也是研究工作的重点，或许对matK序列可以起到补充作用[13-14]。

[1]Tautz D，Arctander P，Minelli A，et al. A plea for DNA taxonomy[J]. Trends in Ecology and Evolution，2003，18(2)：70-74.

[2]郭 锐，张守纯，宋艳珠. 9种鹤类DNA条形码的研究[J]. 中国农学通报，2012，28(14)：50-55.

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[7]张 欣，于瑞祥，方晓明，等. 橄榄油掺假检测技术的研究进展[J]. 中国油脂，2013，38(3)：67-71.

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[13]刘宇婧，刘 越，黄耀江，等. 植物DNA条形码技术的发展及应用[J]. 植物资源与环境学报，2011，20(1)：74-82，93.

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TheapplicationofmatKsequenceasDNAbarcodeinXanthium

HU Wei-yi1，SHAO Tao-xi2

(1.Lianyungang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Lianyungang 222042，China；2.Ganyu Tashan Agricultural Technology Service Center，Ganyu222042，China)

MatK sequence was used as DNA barcode to distinguish and indentify seven plant species in the genusXanthiumof foreign origin. DNeasy® Plant Mini Kit was used to extract the total DNA. A universal primer was used to amplify matK genes for sequencing. The matK sequences of the sevenXanthiumspecies were contrasted and analyzed by MEGA 5.1 software，and a phylogenetic tree was constructed. The matK sequences were able to distinguish and indentifyXanthiumplants at the gene level.

matK sequence；DNA barcode；Xanthium

S41-30

A

1003-935X(2013)04-0013-04

胡伟毅，邵套喜. matK序列作为DNA条形码在苍耳属中的应用[J]. 杂草科学，2013，31(4)：13-16.

2013-09-13

江苏出入境检验检疫局科技项目(编号：2012KJ54)。

胡伟毅(1984—)，男，硕士，主要从事港口外来有害生物截获工作。E-mail：94087540@qq.com。