大鼠胃溃疡自愈期间胃黏膜EGF mRNA、EGFR mRNA的表达

马义腾，张 静，吴靖芳，寇金庆，张江兰，张 耕

（1.河北北方学院临床医学本科2010级2班，河北 张家口 075000；2.河北北方学院基础医学院组织胚胎学教研室，河北 张家口 075000；3.河北北方学院临床医学本科2010级1班，河北 张家口 075000）

胃溃疡的形成及愈合涉及到胃黏膜侵袭因素与黏膜、自身防御－修复因素，而表皮生长因子 （epider-mal growth factor，EGF）是一种具有促进细胞增殖和分化的重要生物活性肽，在维持黏膜完整性方面具有重要作用，它通过与细胞表面的受体 （epidermal growth factor receptor，EGFR）结合而发挥作用［1］。二者在基因水平的表达是其在蛋白水平发挥功能的基础，因此我们建立大鼠胃溃疡模型，通过采用半定量转录－聚合酶链反应 （reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法检测大鼠胃黏膜EGF mRNA、EGFR mRNA在胃溃疡自愈期间的表达情况，探讨二者在胃黏膜修复中的意义及半定量RT-PCR法用于此项检测的价值。

1 材料与方法

1.1 材料

Redzol、DEPC购自北京赛百盛生物工程有限公司，dNTP Mix、DL2000，Goldview、M-MLV反转录酶，RNase抑制剂购自Gene Copoeia公司；2×Taq PCR体系购自北京盛旭百川生物工程公司，引物由北京赛百盛生物工程有限公司合成。

1.2 动物模型建立

8周龄雄性SD大鼠 （购自北京维通利华实验动物技术有限公司）共36只，体质量 （180～230）g。分为溃疡组和正常组。溃疡组在胃体前壁近胃窦处注射0.01mL冰乙酸制备胃溃疡模型；正常组不做处理。溃疡组分别于制成模型后1、4、6、10、14d（每组6只）取材，正常组 （6只）与溃疡1d组同时取材。取材前各组动物禁食12h，经3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，迅速开胸取胃，取溃疡旁胃组织及正常组近胃窦胃组织约100mg经DEPC水清洗后迅速置于液氮中以备RT-PCR检测。

1.3 RT-PCR检测EGF、EGFR mRNA的表达

①提取胃黏膜总RNA：100mg组织剪碎，加入1mL Redzol充分研磨，将裂解液移入到1.5mL EP管中，室温放置5min。加200μL氯仿，剧烈摇动30s，室温3min，12 000r·min－1（4℃）离心15 min。取上层无色水相移入另一EP管中，加等体积异丙醇，室温下放置10min，12 000r·min－1（4℃）离心15min。管底部可见白色RNA沉淀。弃上清，加1mL 75%乙醇洗涤，7 500r·min－1（4℃）离心5 min，弃上清，室温干燥5～10min后溶于一定量DEPC水中，保存于-70℃超低温冰箱中；②RNA完整性检测：5μL RNA加1μL上样缓冲液在1.5%琼脂糖中电泳，用UVP GELDOC-IT凝胶成像系统观察；③RNA纯度及浓度测定：DEPC水按一定比例稀释后RNA经紫外分光光度计分别测量260、280nm的吸光度值，根据比值检测RNA纯度，同时根据260nm吸光度值 （absorbance，A），计算每组RNA浓度，并进行调整，使其保持一致；④反转录：反应总体系20μL，其中总RNA 2.5μL，随机引物1μL，M-MLV 1μL，dNTPs 2μL，RNase抑制剂1μL；⑤PCR扩增反应：总体系20μL，其中cDNA 2μL，EGF引物序列为：上游5′-GCCAAGCTCAGAAGGCTAC-3′，下游5′-CAGGCCAGCCTCGTCTCAT-3′，扩增条件94℃30s，54℃30s，72℃1min，循环35次，产物361bp；EGFR引物序列为：上游5′－TCGGTGCTGTGCGATTTA-3′，下游5′-TTTCTGGCAGTTGCTCCTC-3′，扩增条件94℃30s，53℃30s，72℃1min，循环35次，产物194bp；GAPDH引物序列为：上游5′-CAGTGCCAGCCTCGTCTCAT-3′，下游5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′，扩增条件94℃30s，58℃30s，72℃1min，循环35次，产物595bp。PCR产物测定及分析：PCR反应产物在1.5%琼脂糖中电泳，用UVP GELDOCIT凝胶成像系统观察。

1.4 图像观察与半定量分析

用凝胶成像系统观察并检测EGF、EGFR扩增产物与GAPDH的吸光度 （A）值，根据EGF、EGFR与GAPDH的吸光度比值对其进行半定量分析。数据均用 （±s）表示，应用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析和q检验。

2 结 果

2.1 大鼠胃溃疡模型的建立

胃溃疡术后1d，大鼠胃前壁即可见边界清楚的溃疡形成，周围黏膜隆起 （图1）；4、6d组溃疡更为明显，随后溃疡逐渐缩小，部分愈合。

2.2 RT-PCR检测大鼠胃组织EGF mRNA、EGFR mRNA的表达

所提取的mRNA完整性良好 （图2），28srRNA和18srRNA条带清楚并完整，无拖带和污染。A260／A280比值在1.8～2.0之间，其纯度良好。EGF mRNA （图3A）、EGFR mRNA （图3B）、GAPDH（图3C）扩增产物分别是250～500bp、100～250bp、500～750bp的一条清晰扩增带，结果显示EGF mRNA、EGFR mRNA在术后表达逐渐增强，二者分别在溃疡10d、溃疡6d组表达最强，之后稍减弱（表1，图4）。

表1 大鼠胃黏膜EGF／GAPDH mRNA、EGFR／GAPDH mRNA OD比值（±s）

表1 大鼠胃黏膜EGF／GAPDH mRNA、EGFR／GAPDH mRNA OD比值（±s）

注：与正常组相比：▲P＜0.01；与前一溃疡组相比：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

正常组 溃疡1d 溃疡4d 溃疡6d 溃疡10d 溃疡14d EGF 0.80±0.13 1.10±0.04▲ 1.68±0.06▲＊＊ 1.73±0.14▲ 1.99±0.10▲＊＊ 1.68±0.05▲＊＊EGFR 0.83±0.04 1.44±0.13▲＊＊ 1.53±0.13▲ 1.69±0.10▲＊ 1.49±0.15▲＊＊ 1.37±0.10▲

图1 大鼠胃溃疡术后1d胃粘膜溃疡形成 （→）

图2 大鼠胃黏膜总RNA电泳图

图3 RT-PCR法测得的EGF mRNA （4A），EGFR mRNA （4B），GAPDH mRNA （4C）的结果 M：Marker；N：正常组；1、4、6、10、14分别代表1、4、6、10、14d溃疡组。

图4 大鼠胃黏膜EGF／GAPDH mRNA、EGFR／GAPDH mRNA A比值

3 讨 论

胃溃疡是消化道常见的疾病，且有5%的胃溃疡能发生恶变，溃疡后黏膜的修复过程关系到疾病的发展与转归，研究表明溃疡的愈合质量与EGF及EGFR的表达密切相关［2］。EGF是重要的黏膜修复因子，是生长因子家族中第一个发挥作用的［3］，它与靶细胞上的受体EGFR结合后，激活EGFR-ERK信号传导系统发挥生物学效应［4］。EGF能够抑制胃酸分泌，促进上皮细胞增生，在保护胃黏膜免受损伤因子的破坏，维持黏膜完整性方面起到重要的作用［5］。EGFR是具有酪氨酸激酶活性的一种跨膜糖蛋白受体，与EGF具有较高的特异性亲合力［6］，能传递EGF家族的生物学活性并使其完全表达，并可提高损伤部位旁EGFR数目，从而促进损伤黏膜上皮的修复［7］。

本实验结果显示大鼠胃溃疡自愈期间胃黏膜能够内源性地表达EGF mRNA及EGFR mRNA，并在溃疡后黏膜愈合早期、中期呈现渐增趋势，在愈合晚期略有下降，两种因子的表达规律与胃溃疡的愈合是一致的，并与我们课题组在检测两种因子蛋白水平的变化趋势也是一致的［8］，两种因子在基因水平的表达是决定其在蛋白翻译水平发挥功能的基础。研究表明，EGFR是早期反应基因，出现时间早于中间反应基因EGF［9］，我们实验数据显示在溃疡术后1d，EGFR mRNA表达即增强，至术后6d表达最强，EGF mRNA于术后4d增强较为明显，术后10d表达最强，与国外文献报道一致。

本实验中，我们采用半定量RT-PCR法检测EGF mRNA和EGFR mRNA的表达，RT-PCR法是近几年常用的一种检测RNA的技术方法，将mRNA先反转录成cDNA，再进行PCR扩增，以推测各样品中特异mRNA的相对含量。实时定量PCR法虽能精确计算基因表达量，但减少了扩增后电泳的检测步骤，因此不能监测扩增产物的大小；同时此方法实验成本较高也限制了其广泛的应用。而半定量RT-PCR法对试验条件的要求不高，方便快捷，一般实验室即能开展，其主要特点是选一个表达稳定的内参基因（β-actin或GAPDH）作为比较标准，通过得到的待测基因与内参基因条带吸光度比值，来分析各实验组RNA的含量［10］。此方法能消除实验中的误差，采用的是相对值而不是绝对值，在比较各实验组样品之间mRNA的表达差异时能够足以说明问题，因此在各个研究领域都有着非常广泛的应用。RT-PCR实验成功与否与实验操作关系密切。在提取总RNA时要严格防止RNA酶污染，组织尽可能碾碎，并充分与RNA抽提试剂混合，以获得足量的RNA。吸取氯仿离心后上层含RNA的水相时应遵循宁少勿多的原则，避免吸入中间层的DNA和下层的蛋白质。同时要对RNA进行纯度分析，紫外光下观察凝胶电泳后RNA，一般会出现28S、18S2条带，而且28S条带的亮度是18S的2倍时，表明RNA的完整性较好。紫外分光光度计测量A260／A280的值在1.8～2.0之间时，说明纯度比较高，如果比值低，说明有蛋白质污染，而比值高说明RNA已水解成单核酸了。在进行反转录cDNA第一链时一般可应用试剂盒，需要注意的是要对各样本的RNA浓度进行调整，通过A260值计算出浓度，统一调整至各组RNA浓度一致，再进行反转录。进行半定量PCR反应时要选择合适的内参，β-actin或GAPDH均可。半定量RT-PCR技术是利用产物与模板的线性关系，来检测总RNA中目的基因的表达。但是如果循环数较多，扩增反应会随着酶活性下降和反应物的消耗进入平台期。在平台期的扩增使低水平表达的目的RNA可能会增加，产生非特异性，因此要经过反复实验选择合适的循环数。退火温度也是PCR反应的关键环节，是引物和模板结合时的温度参数，是影响PCR特异性的较重要因素。退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合，因此可通过PCR仪梯度设置退火温度选择最为合适的条件，建立优化的PCR体系。

我们实验表明胃黏膜在胃溃疡愈合的过程中可自身产生EGF mRNA和EGFR mRNA，二者在基因水平上的表达直接影响蛋白水平功能的发挥，在胃溃疡愈合过程中起到了促进的作用，同时半定量RT-PCR法在检测基因表达水平方面是一个强有力的研究手段，但在关键环节中要加以注意，才能得到可靠准确的实验结果。

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