银杏多糖对四氯化碳诱导急性小鼠肝损伤的保护作用

张福华，尹 丽

(漯河医学高等专科学校，河南漯河 462002)

银杏作为我国特有的物种，含有很多活性物质。银杏叶、银杏外种皮、白果、银杏花粉等都有提取银杏活性物质的报道。研究发现，银杏中的有效成分可以有效抗氧化、清除自由基、抑菌、增强小鼠免疫功能、保护四氯化碳引起的肝损伤等作用［1～3］。目前关于银杏多糖的提取研究很多，并已经得到晶体［4］。研究发现，银杏多糖有一定的抗氧化能力［5～7］，但关于银杏多糖的体内实验甚少。本实验主要研究银杏多糖对四氯化碳诱导的小鼠肝损伤的保护作用，揭示其机制并为进一步的研究提供参考。

1 材料

1.1 材料与试剂

银杏叶(11月份，采自漯河医学高等专科学校校园内)经漯河医学高等专科学校任亮副教授鉴定为银杏树(Ginkgo Biloba)的叶。谷丙转氨酶(ALT)试剂盒、谷草转氨酶(AST)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)试剂盒均购自南京建成生物研究所。NO TNF-α试剂盒购自武汉博士德有限公司，联苯双酯购自北京协和药厂，CCl购自上海申鹤化学品有限公司，其他试剂均为市售分析纯。

1.2 动物

昆明小鼠共60只(雌雄各半)，体质量20±2 g，由河南省实验动物中心提供(许可证号 SCXK(豫)2005-008)。

1.3 仪器设备

RE-52A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，722s分光光度仪(上海第三分析仪器厂)，HH-8数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)，ZS83-1型内切式组织匀浆机(浙西机械厂)，CKX41荧光倒置显微镜(Olympus公司)，DU640紫外可见分光光度计(Backman，美国)。

2 方法

2.1 银杏多糖的提取［8，9］

取银杏叶1000g蒸馏水洗净80℃烘干12h，取出粉碎过80目筛。取烘干品100g加入15倍体积蒸馏水，75℃下水浴浸提5h，浸提2次，合并2次滤液，旋转蒸发仪60℃直到体积为原体积的1/3。然后浓缩液3000rpm离心20min，加入3000ml 95%乙醇，静置24 h收集沉淀。用蒸馏水反复洗涤，然后用Sevag方法去除沉淀中蛋白质，在核酸最大吸收波长260nm、蛋白质最大吸收波长280nm进行检测，无明显吸收峰。再用无水乙醇脱水，之后用乙醚洗涤脱脂，最终得到灰白色银杏多糖粗制品。经称量4.15g，得率为4.15%，用时稀释。

2.3 动物分组与药物处理

60只昆明小鼠随机分为6组，分别为空白组、模型组、联苯双酯组、银杏多糖高、中、低剂量组，每组10只。其中，银杏多糖低、中、高剂量组分别以银杏多糖 200、100、50 mg·kg－1，1 次·d－1进行灌胃;对照组(联苯双酯组)联苯双酯100 mg·kg－1进行灌胃;空白组和模型组分别以生理盐水灌胃，连续2周。第14周隔夜禁食12 h后，模型组、银杏多糖高中低剂量组和对照组小鼠分别腹腔注射0.15%CCl4花生油溶液2ml/只，空白组腹腔注射等剂量花生油，24 h后摘眼球取血，取血前12h小鼠禁食不禁水。然后处死小鼠取肝脏称其重量，0℃左右生理盐水冲洗干净残留血液，制备肝组织匀浆待用。

2.4 组织学观察

观察肝脏的形态和颜色，甲醛溶液固定、常规HE染色，在光镜下观察肝组织切片的结构等组织学形态变化。

2.5 生化指标检测

血清 ALT、AST 及肝脏 SOD、MDA、GSH-Px、NO、TNF-α测定方法均按试剂盒说明书进行。

2.6 统计学方法

应用SPSS16.0软件进行统计分析，计量数据以均数±标准差(珋x±s)表示，组间比较采用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 肝组织学观察

对照组小鼠肝脏颜色光泽鲜亮有弹性且呈红褐色，光镜下观察可见肝小叶结构轮廓清晰，细胞核大而圆，胞浆致密。模型组小鼠肝脏色泽黯淡，表面粗糙。肝小叶结构模糊且紊乱，细胞体积增大，肝细胞成片坏死。银杏多糖高、中、低剂量组和对照组形态要好于模型组，但仍然有坏死区域，且不连成片，多呈点状，这表明银杏多糖对肝损伤有一定保护作用。

3.2 银杏多糖对CCl4小鼠生化指标的影响

模型组小鼠中血清ALT、AST活性、MDA含量明显大于对照组，提示造模成功。

表1、2显示，与空白对组比较，模型组和银杏多糖低中高剂量组小鼠血清中ALT、AST、MOD含量明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，银杏多糖低、中、高剂量组能明显降低小鼠血清中ALT、AST活性，并与浓度有很大的依赖性。正常情况下，AST、ALT是细胞内酶，血清中含量很少，但当该细胞损伤时，细胞膜通透性增加，酶从细胞内释放到细胞外，从而导致血清中酶的浓度增加，活性增加，MDA含量升高。实验结果提示，银杏多糖对CCl4导致的小鼠肝细胞损伤有一定的保护作用，模型组小鼠肝组织中SOD及GSH-Px活性水平显著低于正常组(P＜0.01)。与模型组比较，银杏多糖低中高剂量组小鼠肝组织中SOD和GSH-Px活性显著增加(P＜0.01)。结果显示，银杏多糖能显著抑制肝损伤小鼠肝组织中SOD和GSH-Px活性的降低，提示银杏多糖有很强的抗氧化能力。

表1 银杏多糖对肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响(珔x±s，n=10)

3.3 银杏多糖对肝损伤小鼠肝组织NO、TNF-α含量的影响

表3显示，银杏多糖可显著降低肝损伤小鼠血清中NO、TNF-α的含量，与浓度有一定的依赖关系，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表3 银杏多糖对肝损伤小鼠肝组织中NO、TNF-α含量的影响(珔x±s，n=10)

4 讨论

肝脏的一大特征就是含有丰富的酶类，代谢特别活跃，而这些代谢活动的主角是血窦中的血管内皮细胞和星状细胞。当肝功能持续障碍一定时间后，星状细胞的性质就会发生改变并制造很多骨胶原，导致肝脏纤维化，同时星状细胞还会制造平滑肌激动蛋白，收缩血窦。

四氯化碳可直接损害肝细胞引起一些特异变化。四氯化碳在肝脏可代谢生成CCl3自由基和Cl自由基，这2种自由基会破坏细胞膜上的脂质和蛋白质大分子，引起代谢障碍，导致脂质过氧化反应，从而增强细胞膜的通透性，导致正常情况下位于细胞内的酶外流，而ALT和AST主要存在于肝细胞中，所以这2种酶在一定程度上可以反映肝细胞的损伤程度。另外，MDA也是反映肝损伤程度的有效指标，其含量越高说明肝细胞膜脂质过氧化越强，受损越严重［10］。再者·CCl3自由基可以抑制细胞膜和微粒体膜的钙泵活性，钙离子内流［11］从而导致胞内钙离子浓度增加。SOD、GSH-Px是体内重要的抗氧化酶类，可以有效清除机体产生的自由基，减弱机体的氧化应激状态。该研究表明，不同剂量的银杏多糖可以显著降低小鼠血清中ALT、AST、MDA含量，并能提高SOD、GSH-Px活性，显示银杏多糖对四氯化碳引起的小鼠肝损伤有一定的保护作用，且与浓度直接相关。同时SOD、GSH-Px的活性升高和2种酶活性的升高保持一致关系，暗示银杏多糖主要通过清除损伤小鼠体内的自由基来对其进行有效保护。

Kupffer细胞(KCs)是肝脏血窦内的常驻细胞，肝脏是门静脉血流汇入的器官，同时也会带来抗原、细菌等。而KCs可以去除其中的抗原细菌等异物，同时也会引起炎症反应。受其他物质的影响(如干扰素γ、白细胞介素-12(IL-2)，KCs会增生、活化，从而释放出各种胞质变动物质和活性氧，引起肝脏障碍。TNF-α主要有肝脏kuffer细胞和肝实质细胞产生，是肝脏疾病发生和发展的关键因素。综合研究数据发现，TNF-α的水平和肝脏病变的严重程度正相关，过高浓度的TNF-α可以诱导肝细胞凋亡和坏死［12，13］。研究发现，抗氧化物质的缺乏可以导致小鼠肝细胞对 TNF-α介导的肝损伤更加敏感［14］。TNF-α对血管内皮细胞产生损害，导致其功能代谢紊乱，在肝实质细胞和Kupffer细胞、肝内皮细胞诱导型NOS合酶的作用下产生NO，而诱导型NO会通过抑制肝细胞翻译过程和损伤遗传物质DNA加重肝脏的受损程度，诱导细胞死亡。同时，NO本身作为一种自由基也会加重机体的氧化应激状态。该研究揭示，银杏多糖可以有效降低四氯化碳导致的小鼠肝组织中NO、TNF-α的含量，对小鼠肝脏有一定的保护作用。

该研究发现，漯河地区银杏叶中提取的银杏多糖得率为4.15%，对四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤导致 ALT、AST、MDA、SOD、GSH-Px的含量增高可以有效抑制，同时能显著降低肝损伤小鼠血清中NO、TNF-α的含量，提示银杏多糖可能通过清除诱导小鼠体内自由基、提高抗氧化作用而对诱导小鼠起到保护作用。

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