同种异基因骨髓移植小鼠aGVHD模型的建立

北京市怀柔区第一医院（101400）宁涓

造血干细胞移植（HSCT）尤其是异基因HSCT（allo-HSCT）现广泛应用于血液肿瘤或非血液恶性肿瘤、再生障碍性贫血、某些遗传性疾病等的治疗，甚至认为allo-HSCT是治愈某些血液肿瘤和遗传性疾病的唯一方法。目前，移植物抗宿主病（GVHD）仍是allo-HSCT移植后相关死亡的主要原因，是移植的首要障碍，即使在接受HLA配型完全相合的同胞供者移植的患者中，也常发生严重的急性移植物抗宿主病（aGVHD）而致死。因此，利用动物型模来研究aGVHD的发病机理，具有十分重要的理论和实用价值。因此，我院利用C57BL/6（H-2b）和BALB/c（H-2d）小鼠来建立一种稳定可靠的同种异基因骨髓移植（BMT）aGVHD模型，以便更好的研究aGVHD的发病机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 ①清洁级雌性BALB/c（H-2d）小鼠36只，6～8w，18～22g；②清洁级雄性BALB/c（H-2d）小鼠24只，6～8w，18～22g；③清洁级雄性C57BL/6（H-2b）小鼠24只，6～8w，18～22g；均购自首都医科大学实验动物中心，并在首都医科大学实验动物中心层流房中饲养。

1.1.2 主要试剂及其配置 含抗生素的饮用水（红霉素250mg/L，庆大霉素32×104U/L，氟哌酸200mg/L），PBS缓冲液（NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO41.44g、KH2PO40.24g溶解后加三蒸水至1L，调pH 7.2，4℃保存），RPMI-1640培养液（GIBCO公司），红细胞裂解液（Tris 2.6g、NH4Cl 7.47g溶于1L三蒸水中，0.22µm滤膜过滤除菌，调pH 7.2，4℃保存），PCR引物合成（英骏生物技术有限公司），普通PCR试剂盒（深圳中晶生物技术有限公司），琼脂糖粉（sigma公司），DNA Marker（上海申能博采公司），3S Spin Genomic DNA Miniprep Kit V3.0（上海申能博采公司）。

1.1.3 实验仪器 普通离心机：LD-2A型（北京医用离心机厂制造），低温高速台式离心机（Universal 32，德国），PTC-0200型PCR仪（美国），恒温恒压电泳仪（国产），YH-1型超净工作台（广州），Olympus倒置显微镜（Olympus公司，日本），X线直线加速器-231型（VARIAN公司，美国），凝胶图像光密度分析仪UVP-GDS型（英国），紫外分光光度计GeneQuant Ⅱ（Pharmacia Biotech公司，英国），200目不锈钢筛网（广州），微量加样器（0.5-1000µL，Eppendorf）。

1.2 方法

1.2.1 受鼠准备 移植前1w将BALB/c（H-2d）小鼠置于空气层流房的动物饲养空气层流柜中无菌饲养，所有垫料、饲料及饮用水均经高压灭菌处理，移植前5d接受含抗生素的饮用水直至移植后2w。

1.2.2 预处理 移植4h前BALB/c（H-2d）小鼠接受全身照射（TBI），总剂量为8.0Gy，剂量率为0.5Gy/min，照射源与动物之间间隔90cm。

1.2.3 造血干细胞和淋巴细胞移植

1.2.3.1 供鼠骨髓单个核细胞分离 ①断颈处死供鼠，75%酒精浸泡5min，在超净台内将小鼠腹部向上平放，在腹区下部皮肤上做一长横切口，剥开皮肤，露出臀部及后肢。②用鼠齿镊拉紧后肢，用剪刀尽可能将肌肉剪开，在髋关节处将后肢与躯干分离，分离时勿伤长骨骨骺，取下的后肢放入有RPMI-1640培养液的平皿中。③用剪刀尽可能去除股骨及胫骨表面黏附的肌肉，将胫骨、股骨放入RPMI-1640培养液的平皿中浸泡5min，更换器械，严格无菌操作；然后剪开两端的骨骺，用1mL注射器针头刺入骨髓腔中。④用装有RPMI-1640培养液的注射器反复冲洗骨髓腔，冲洗液装入10mL无菌离心管，用吸管反复吹打，静置片刻，去除试管底部沉淀；用红细胞裂解液裂解红细胞；之后离心，去除上清液（1500rpm，5min），加RPMI-1640培养液洗涤1次，再加入RPMI-1640液培养液2mL，反复吹打使细胞充分混匀，随后在显微镜下计数有核细胞的数量，最后用RPMI-1640培养液调整细胞浓度为1×108/mL，备用。

附表1 小鼠分组

附表2 各组小鼠平均存活时间

1.2.3.2 供鼠淋巴细胞悬液的制备 ①在供鼠腹区沿腹部中线做一纵切口，打开腹腔，取下脾脏（尽量剔除脂肪组织），置于预先加入5mL RPMI-1640培养液的无菌平皿中。②在平皿中用注射器针芯在无菌200目不锈钢筛网上轻轻研磨脾脏，并用移液管吸取RPMI-1640培养液冲洗不锈钢筛网，冲洗2遍，移至10mL刻度离心管，以1000rpm（常规台式离心机）离心10min，加入5mL预冷的红细胞裂解液，混匀，静置6min，加入RPMI-1640培养液5mL中止裂解液裂解，1000rpm离心10min，RPMI-1640培养液洗涤2遍，以RPMI-1640培养液调整细胞浓度为3×108/mL，备用。③将上述两种细胞悬液等体积混合，此时脾细胞浓度为1.5×108/mL，骨髓细胞浓度为0.5×108/mL，小鼠移植前4h行X射线全身照射（TBI 8.0Gy，计量率0.5Gy/min），在无菌条件下用1mL注射器沿受鼠尾静脉输注供鼠骨髓细胞和淋巴细胞混合悬液0.2mL，此时脾细胞数为3×107，骨髓细胞数为1×107。

1.2.4 小鼠分组及造血干细胞和淋巴细胞移植见附表1。

附图1 各组小鼠肝脏表现

1.2.5 结果判断标准

1.2.5.1 移植植活状态好 体重增加，脾脏见到明显的脾结节，外周血WBC＞1.0×109/L，PCR可检测出Y染色体。

1.2.5.2 移植失败 照射后很快死亡，死亡时外周血WBC＜0.5×109/L，没有嵌合体形成。

1.2.5.3 感染 外周血WBC＞0.5×109/L，外周血见中性粒细胞核左移，胞浆中有中毒颗粒。

1.2.5.4 aGVHD的判断标准 外周血WBC＞1.0×109/L，且伴有倦怠，精神萎靡，嗜睡，食欲下降，体重下降，弓背，脱毛，腹泻，出血；病理检查可见肝脏、脾脏组织淋巴细胞浸润，正常组织结构破坏。

1.2.6 统计学分析 所有数据均采用SPSS13.0统计软件包进行处理，小鼠造血重建时间采用独立样本t检验，受鼠生存时间采用K Independent Samples Test分析。

2 结果

2.1 造血重建 本研究动态观察结果表明，预处理后第3d三组受鼠WBC＜1×109/L，且单纯照射组WBC始终＜1×109/L，同基因组和异基因组WBC＞1.0×109/L的时间分别为9.33±2.31d、10.33±1.65d（P＝0.501），两组造血重建时间差异无统计学意义。

2.2 小鼠一般状况和aGVHD观察 三组小鼠照射后前6d变化类似：体重进行性下降，伴活动减少，嗜睡，皱毛，弓背但无腹泻。A组小鼠于第6d开始死亡，死亡高峰在移植后9～12d，第12d全部死亡；B组小鼠第7d起体重逐渐增加，至移植后3w时体重恢复正常并继续增加，该组小鼠未出现aGVHD的症状，全部存活时间＞60d；C组小鼠第7～10d体重略回升，11d后体重再度开始下降，并在11d左右再次出现活动减少，嗜睡，弓背，脱毛，腹泻等典型GVHD表现[1]，死亡高峰在移植后15～17d，第17d全部死亡，三组小鼠生存时间存在显著性差异（P＜0.01）。各组小鼠移植后平均存活时间见附表2。

2.3 GVHD发生率 A组、B组小鼠未发生aGVHD，C组小鼠全部出现aGVHD表现，发生率100%。

2.4 生存期观察 经统计学分析，A、B、C三组小鼠间的生存时间存在显著差异（Log rank＝28.025，P＝0.000）。

2.5 移植后各组小鼠肝脏、脾脏的GVHD相关病理形态学改变 对各组小鼠的肝脏、脾脏标本作常规病理切片结果显示：三组小鼠肝脏、脾脏第3d、第7d未见病变；单纯照射组小鼠第12d（濒死前）肝脏病变：肝脏部分肝细胞轻度水肿，出现空泡；脾脏髓质脾小体明显消失，大量红细胞坏死，含铁血黄素沉积。同基因骨髓移植组小鼠肝脏第14d病理学检查未见异常；脾脏可见脾小体缩小，髓质淋巴细胞未减少，纤维组织增生。异基因骨髓移植组小鼠第14d（发生aGVHD后3d）肝脏病变：肝脏出现肝细胞点状坏死，嗜酸性变，汇管区淋巴细胞浸润；脾脏髓质脾小体消失，脾窦扩张、淤血、纤维组织增生，组织细胞增生典型，见附图1和2。

2.6 PCR法特异性扩增Y染色体进行嵌合体检测 移植后生存时间＞10d的所有小鼠（BALB/c，♀）进行PCR法扩增外周血Y染色体检查，全部均检查到Y染色体，提示供鼠（C57BL/6，♂）骨髓细胞植入成功。

3 讨论

HSCT广泛用于恶性与非恶性疾病的治疗，尤其是allo-HSCT被认为是治愈某些疾病的唯一方法。移植发展至今，尽管在许多方向获得极大发展，但影响allo-HSCT预后的最主要并发症GVHD仍未得到很好解决。同种异体HSCT后GVHD的发生率高达50%～80%，并造成30%的移植相关死亡率，严重影响移植后患者的生存时间和生存质量[2]。因此，需要建立一种稳定可靠的GVHD动物模型以便更好地研究防治GVHD的方法具有十分重要的意义。鉴于此，笔者利用C57BL/6（H-2b）和BALB/c（H-2d）小鼠来建立一种稳定可靠的同种异基因骨髓移植（BMT）aGVHD模型。

附图2 各组小鼠脾脏病理特点

GVHD主要是由T细胞介导的免疫反应，是由供者来源的T细胞识别受者的主要组织相容性和/或次要组织相容性抗原从而被活化，通过释放炎症细胞因子和直接杀伤作用，损伤受者组织器官的免疫病理过程[3][4][5][6]。众多因素与GVHD的发生有关，其中移植物中免疫活性细胞的数量、供受者之间的组织相容性抗原不合和宿主缺乏对移植物发动免疫攻击能力是GVHD发生的3个必备条件。在小鼠aGVHD动物模型中为满足上述3个条件，笔者对小鼠进行骨髓移植前预处理，移植前4h利用X射线全身照射（total body irradiation，TBI），总剂量8.0Gy，剂量率为0.5Gy/min，照射的目的是清除受者的骨髓造血组织并抑制受者的免疫功能。目前研究认为，GVHD的效应是供体的活化淋巴细胞，有文献报道当移植的脾细胞＞1×107个时，方可造成典型的aGVHD的征象，骨髓细胞必须＞1×106个时方可以保证成功地植入。本研究骨髓细胞数和脾细胞数分别为1×107和3×107，满足实验要求。

本研究中单纯照射组小鼠照射后6～12d全部死亡，同基因移植组小鼠全部长期生存，无aGVHD征象，实验组小鼠移植后11d再次出现活动减少，嗜睡，弓背，脱毛，腹泻等典型aGVHD表现；肝脏、脾脏、皮肤病理切片检查小鼠符合aGVHD征象；aGVHD的发病率100%。同时对同基因移植组和异基因移植组生存时间＞10d的所有小鼠（BALB/c，♀）进行PCR法扩增外周血Y染色体检查，全部均检查到Y染色体，提示供鼠（C57BL/6，♂）骨髓细胞植入成功。笔者成功建立同种异基因骨髓移植模型，且aGVHD表现典型，发病率100%，从开始发生aGVHD至小鼠全部死亡有7d时间，为笔者提供充分观察aGVHD的时间。

综上所述，C57BL/6→BALB/C作为MHC不相合异基因移植动物模型，具有重复性好，发病率高，aGVHD表现典型，可作为aGVHD研究的理想参照。