亚低温对脑出血后内源性神经干细胞增殖及迁移的影响

解燕春 关景霞 周 琴 梁静静 曾艳平

成年哺乳动物脑内侧脑室下区（subventricular zone，SVZ）和海马齿状回颗粒下层（subgranular zone，SGZ）存在神经干细胞（neural stem cells，NSCs）［1］。近年来研究证实［2］，脑出血能激活内源性NSCs增殖，并迁移至血肿周围，从而促进脑出血后的神经修复。亚低温能否促进脑出血后内源性神经再生尚不清楚，本实验通过动态观察脑出血在亚低温干预后同侧SVZ及血肿周围NSCs，探讨其对脑出血后内源性NSCs的影响。

1 材料与方法

1.1 动物模型制作及分组

健康雄性清洁级SD大鼠48只，体重（200±20）g。SD大鼠用1%戊巴比妥钠（40 mg／kg）腹腔注射麻醉，固定于立体定位仪上，头皮正中切开，剪开骨膜，暴露前囟，于颅骨背侧前囟后0.2 mm，中线旁3mm处钻一直径为2 mm的孔。用固定于立体定位仪上30号无菌针头沿针孔垂直进针，进针深度为5.8 mm（此为尾状核的位置），注射溶有胶原酶0.4IU的生理盐水2μl。随机分为对照组和亚低温组，每组又分为7、14、21、28 d四个亚组，每亚组6只大鼠。对照组肛温保持在（37±0.5）℃，亚低温组术后立即开始诱导亚低温，且持续24 h。

1.2 亚低温处理

亚低温组予以冰袋加全身喷洒稀释乙醇降温，用电子温度计 （欧姆龙大连有限公司）监测深部肛温（插入深度≥5 cm），每30 min测量一次肛温，温度控制在（34±1）℃，当肛温低于33℃时，用60 W白炽灯照射大鼠躯干部升温，24 h后撤去冰块及白炽灯，使体温自然恢复正常。

1.3 NSCs的标记

脑出血模型制作后腹腔注射细胞增殖特异性标记物BrdU（10 mg／ml溶于生理盐水，50 mg·kg－1·次－1）标记处于增殖状态的 NSCs，2次／d，直至在相应的时间点处死大鼠。

1.4 BrdU免疫组织化学染色

各组动物在相应的时间点经心脏进行灌注，断头取脑，以注入针道为中心，冠状切下组织块，厚约4 mm，剩余部分弃去。组织块放入4% 多聚甲醛内，后固定4 h，换入20%蔗糖溶液中过夜至组织块沉底。标本用恒温冰冻切片机经血肿中心作连续冠状切片，片厚5μm，将切片置于50%甲酰胺2×SSC溶液中65℃温水浴2 h，再置于2N HCl溶液中37℃温水浴30 min进行DNA变性，再用0.1 mol／L硼酸漂洗10 min后以3%H2O2覆盖30 min以封闭内源性过氧化物酶；然后进行亲和素－生物素法染色，一抗为小鼠抗大鼠BrdU，二抗为生物素化的马抗小鼠抗体，DAB显色后，进行水洗、脱水、透明、封片。

1.5 图像及统计学处理

采用HPIAS图像分析系统对同侧SVZ及血肿周围进行图像分析，每张切片对应部位随机抽取8个不重复的高倍视野，进行阳性细胞计数，数据用±s表示。BrdU染色以细胞核内出现棕褐色颗粒为阳性。各组数据用SPSS软件进行组间t比较，显著性水平α＝0.05，当P＜0.05时差异具有显著性意义。

2 结 果

免疫组化方法标记的BrdU阳性细胞呈棕黄色，形态多样，呈圆形、椭圆形或梭形。正常脑细胞染成蓝色。结果显示脑出血后对照组大鼠同侧SVZ和血肿周围BrdU阳性细胞的表达在7 d时开始增加，14 d达到高峰，21 d后开始下降，直至28 d仍有表达。亚低温组大鼠7 d，14 d，21 d及28 d同侧SVZ和血肿周围BrdU阳性细胞较对照组明显增加，且增加的时间较对照组明显延长（P＜0.01），说明脑出血后亚低温干预可以促进SVZ的NSCs增殖，并向血肿周围迁移（图1、2）。

图1 脑出血后同侧SVZ的BrdU阳性细胞

图2 脑出血后血肿周围的BrdU阳性细胞

3 讨 论

脑出血是一种严重危害人类健康的脑卒中亚型，其死亡率和致残率高。目前，脑出血的治疗，如机械清除血肿、药物预防脑水肿及降低颅内压，对脑出血患者功能恢复的作用非常有限。如何更好地促进脑出血患者神经功能的恢复，提高其生活质量，是目前迫切需要解决的问题。

成年哺乳动物脑内NSCs存在于SVZ和SGZ。在生理条件下内源性NSCs可活化增殖，SVZ增殖的NSCs经吻侧迁移流（rostral migratory stream，RMS）迁移到嗅球并分化为GABA能颗粒细胞和多巴胺能神经元，参与嗅神经的再生；而SGZ增殖的NSCs则迁移至颗粒细胞层后分化为颗粒细胞，参与海马神经元的再生。NSCs的发现为各种神经系统疾病带来新的希望。在各种病理状态下，如缺血性卒中及脑外伤等可促进内源性神经再生，在一定程度上改善神经功能。近年来，研究发现胶原酶诱导的脑出血可促进内源性NSCs的增殖，新生的神经元能迁移到血肿周围，这为脑出血后神经修复提供新的思路。本研究主要探讨亚低温能否促进脑出血后NSCs的增殖及迁移。

BrdU是一种胸腺嘧啶脱氧核苷类似物，在细胞有丝分裂的S期，整合入新合成DNA。因此，BrdU阳性细胞可被看作是处于增殖状态的NSCs。本研究结果显示脑出血后对照组大鼠同侧SVZ和血肿周围BrdU阳性细胞的表达在7 d时开始增加，14 d达到高峰，21 d后开始下降，直至28 d仍有表达。亚低温组大鼠各时间点SVZ和血肿周围BrdU阳性细胞较对照组显著增加，且增加的时间较对照组明显延长，差异具有统计学意义，说明脑出血后亚低温干预可以促进SVZ的NSCs增殖，并向血肿周围迁移。

研究发现成体脑组织中神经再生和血管新生紧密相连［3］。新生的血管分泌许多可溶性因子可以促进神经干细胞增殖、分化［4］。而且新生的血管是神经干细胞迁移的“脚手架”［5］，指引它迁移到病灶周围。研究进一步发现新生血管表达血管生成素1（Angiopoietin，Ang1），相邻的 NSCs表达其受体Tie-2。给予Ang1可促进NSCs向病灶周围迁移，而拮抗Tie-2则可抑制NSCs向病灶周围迁移［6］。近年来研究发现脑出血能上调Ang1及其受体Tie－2的表达［7］。Zhou等研究发现凝血酶原能激活脑出血后大鼠血管新生［8］。Lei等研究发现高迁移率族蛋白1可通过促进脑出血后血管新生，从而促进其神经再生及神经功能恢复［9］。我们前期的研究发现亚低温能促进脑梗死后血管新生［10］。因此，本研究推测亚低温可能通过促进脑出血后血管新生从而促进内源性NSCs的增殖、迁移，但其具体机制有待进一步研究。

1 Gage FH.Mammalian neural stem cells.Science，2000，287（5457）：1433-1438.

2 Otero L，Zurita M，Bonilla C，et al.Endogenous neurogenesis after intracerebral hemorrhage.Histol Histopathol，2012，27（3）：303-315.

3 Alvarez-Buylla A，Lim DA.For the long run：maintaining germinal niches in the adult brain.Neuron，2004，41（5）：683-686.

4 Shang J，Deguchi K，Ohta Y，et al.Strong neurogenesis，angiogenesis，synaptogenesis， and antifibrosis of hepatocyte growth factor in rats brain after transient middle cerebral artery occlusion.J Neurosci Res，2011，89（1）：86-95.

5 del Zoppo GJ.The neurovascular unit，matrix proteases，and innate inflammation.Ann N Y Acad Sci，2010，1207：46-49.

6 Ohab JJ，Fleming S，Blesch A，et al.A neurovascular niche for neurogenesis after stroke.J Neurosci，2006，26（50）：13007-13016.

7 Zhou H，Tang T，Guo C，et al.Expression of Angiopoietin-1 and the receptor Tie-2 mRNA in rat brains following intracerebral hemorrhage.Acta Neurobiol Exp（Wars），2008，68（2）：147-154.

8 Zhou HJ，Tang T，Cui HJ，et al.Thrombin-triggered angiogenesis in rat brains following experimental intracerebral hemorrhage.J Neurosurg，2012，117（5）：920-928.

9 Lei C，Lin S，Zhang C，et al.Effects of high-mobility group box1 on cerebral angiogenesis and neurogenesis after intracerebral hemorrhage.Neuroscience，2013，229：12-19.

10 Xie YC，Li CY，Li T，et al.Effect of mild hypothermia on angiogenesis in rats with focal cerebral ischemia.Neurosci Lett，2007，422（2）：87-90.