土壤及畜禽粪肥中四环素类抗生素固相萃取—高效液相色谱法的优化与初步应用

张志强， 李春花， 黄绍文*， 高 伟， 唐继伟

(1 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所/农业部植物营养与肥料重点实验室，北京 100081;2 天津市农业资源与环境研究所，天津 300192)

土壤及畜禽粪肥中四环素类抗生素固相萃取—高效液相色谱法的优化与初步应用

张志强1， 李春花1， 黄绍文1*， 高 伟2， 唐继伟1

(1 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所/农业部植物营养与肥料重点实验室，北京 100081;2 天津市农业资源与环境研究所，天津 300192)

四环素类抗生素残留; 土壤; 畜禽粪便; 固相萃取—高效液相色谱法

Abstract: Tetracyclines(TCs) are the most commonly detected antibiotics reminded in soils and manures in China. The survey of the residual status of tetracyclines is important for evaluating possible biological risks caused by direct exposure of bioorganisms and human beings. In this study, Analytical methods of three kinds of tetraclyinces, oxytetracycline, tetracycline and chlortetracycline, is optimized using SPE-HPLC. The residual status of TCs in soils and manure in Tianjin was investigated using the optimized method. The obtained method recovery rates for soils and manure are increased to the range of 52%-95%. In the surveyed feces samples from intensive piggeries and poultries, CTC is detected in 78% of manures with the highest mg/kg, and OTC and TC are detected in 56% of feces with the highest values of 34.8 and 22.7mg/kg, respectively. TCs are also detected in the market manure in Tianjin with similar residual levels and percentages to those in the feces samples. The total percentage of garden soils containing detectable TCs is 64% of the surveyed soils, and those for OTC, TC and CTC are 18%, 36% and 32%, respectively. The highest values for OTC, TC and CTC are 105.6, 196.7 and 477.8 μg/kg in dry weight respectively. The residual levels in soils under facilities are higher than those in open fields. In 25% of surveyed garden soils, the total amounts of three kinds of TCs are higher than those in the trigger lines causing biological safety.

Keywords: tetracyclines residue; soil; manure; SPE-HPLC

1 材料与方法

1.1 供试设备与试剂

本研究使用Agilent 1100型高效液相色谱仪(Agilent Technologies公司)， 色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18，3.5 μm，4.6 mm×150 mm(Agilent Technologies公司); VisiprepTM-DL型固相萃取装置(Supelco公司); SK8200HP超声波器(中国上海); N-EVAP111氮吹仪(中国北京); 低温离心机(Sigma公司); MS2 Minishaker涡旋混合器(中国广州); 0.22 μm 滤膜(天津津腾); Bond Elut-SAX固相萃取小柱(500 mg/6mL，Agilent Technologies公司)，Poly-Sery HLB 固相萃取小柱(500 mg/6mL，CNW Technologies公司)。

甲醇、 乙腈和丙酮为HPLC级(Fisher公司); 磷酸氢二钠、 柠檬酸、 乙二胺四乙酸二钠、 草酸和三氯乙酸为分析纯(国药公司); 四环素、 土霉素和金霉素纯度大于等于99%(Sigma公司); 溶液配制及洗脱等所用水均为二次蒸馏水。

McIlvaine缓冲溶液: 将625 mL 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液与1000 mL 0.1 mol/L柠檬酸溶液混合，用NaOH或HCl调pH = 4.0±0.05。

0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine缓冲溶液: 称取60.50 g乙二胺四乙酸二钠放入1625 mL McIlvaine缓冲溶液中，使其溶解，摇匀。

TCs混合标准工作溶液: 精确称取0.100 g 土霉素(OTC)、 0.100 g四环素(TC)和0.200 g 金霉素(CTC)，定容于100 mL甲醇中，即得含有浓度为1000 mg/L OTC、 1000 mg/L TC和2000 mg/L CTC的储备液。用混合流动相将混合标准储备液稀释100倍，得到含有10 mg/L OTC、 10 mg/L TC和20 mg/L CTC的混合标准工作溶液，于4 ℃冰箱内保存。

1.2 土壤和有机肥样品的采集

粪肥样品采自天津蔬菜基地附近的9个畜禽养殖场，包括鸡粪样5个、 猪粪样4个。在每个粪堆表层0—30 cm和中层30—50 cm各选5个点采集粪肥，混匀后按照四分法取0.5 kg作为该养殖场的粪肥样品，在-20℃条件下避光保存。商品有机肥为市售商品有机肥，从每种商品有机肥包装袋内5个不同位置采样，混匀后按照四分法取0.5 kg作为供试样品。土壤和有机肥样品风干粉碎后过1 mm筛待用，并测定含水量。

1.3 土壤和有机肥样品的测定

土壤和有机肥样品的处理基本依照孙刚[19]的方法: 称取3.00 g土样或猪、 鸡粪样品1.00 g置于50 mL离心管，加入10 mL 提取液，涡旋1 min后超声提取10 min，于4 ℃、 4500 r/min条件下离心10 min，收取上清液; 沉淀部分再加入8 mL、 6 mL提取液重复以上提取过程两次，合并三次上清液，在40℃下氮吹浓缩至12 mL左右。粪样提取上清液中加入1 mL 10%三氯乙酸溶液摇匀后，静置30 min后浓缩。固相萃取(SPE)小柱(土样只用HLB小柱、 粪样用SAX小柱与HLB小柱串联)依次加入5 mL甲醇、 5 mL二次蒸馏水活化。土壤、 有机肥提取液在真空条件下以流速约1 mL/min全部通过SPE小柱后，用5 mL 5%甲醇水溶液淋洗小柱，并真空抽干10 min。以5 mL洗脱液洗脱小柱，收集该洗脱液并在40 ℃下氮吹浓缩至0.5 mL以下，用混合流动相(0.01 mol/L草酸溶液-乙腈-甲醇的体积比为76-16-8)定容到1 mL，过0.22 μm滤膜后转移至上机瓶，用HPLC测定3种抗生素含量。流动相和洗脱程序根据实验优化结果确定， 流速为1.0 mL/min、 柱温为25 ℃、 检测波长为355 nm、 进样量为20 μL。

1.4 数据处理

本研究采用Microsoft Excel 2003 和SPSS16.0进行数据分析，数据间的差异显著性用Duncan新复极差法检验。

2 结果与分析

2.1 分析方法的优化

2.1.1 色谱仪参数的优化 TCs的流动相一般由缓冲溶液与有机溶剂按一定比例混合组成，0.01 mol/L 草酸溶液是最常用的水相，乙腈和甲醇由于紫外吸收较低，是最为常用的有机溶剂[7,21]。已报道的0.01 mol/L草酸溶液-乙腈-甲醇比例有75-25-0[22]、 79-10.5-10.5[22]、 76-19-5[23]和76-16-8[19]。本实验用OTC、 TC和CTC的加标浓度分别为10、 10和20 mg/L的TCs混合标准溶液对这几种比例的流动相进行了比较。流动相中不含甲醇，OTC和TC不能基线分离(图1a); 乙腈和甲醇同时做有机相且比例相同时，3种抗生素分离效果较好但响应值较低(图1b); 乙腈和甲醇比例为19 ∶5时，OTC和TC的峰形较差(图1c); 乙腈和甲醇比例为2 ∶1时能实现两者的互补，3种抗生素信号峰分离清晰且响应值较高。所以选择三者比例为76-16-8的流动相用于HPLC的测定。

2.1.2 土壤和有机肥样品萃取方法的优化

1) 提取液的确定 本研究对比了0.1 mol/L的Na2EDTA-McIlvaine缓冲溶液(以下简称缓冲溶液)、 缓冲溶液/甲醇等体积混合和缓冲溶液/丙酮(含20%的0.01 mol/L草酸甲醇)等体积混合(图3中依次用A、 B和C表示，每种提取液做4次重复)对提取效率的影响。结果表明，缓冲溶液中加入甲醇或者丙酮都可以显著提高土壤中OTC、 TC和CTC的回收率，加入甲醇可分别提高15.6、 13.2和16.3个百分点，加入丙酮可分别提高16.7、 24.6和20.0个百分点。加入甲醇和丙酮的提取效果相差不大，但由于提取液中加入的有机溶剂需要在上柱之前采用氮吹浓缩法除去，因此有机溶剂的挥发特性大大影响着浓缩过程的快慢。丙酮的挥发性明显强于甲醇，且极性比甲醇弱，对腐植酸的溶解性也较小[25]，因此选择在提取液中加入等体积丙酮(含20%的0.01 mol/L草酸甲醇)作为优化的提取缓冲液。

图1 不同流动相比例TCs标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatograms of tetracyclines obtained in 4 kinds of mobile phases[注(Note): a—0.01 mol/L的草酸溶液/乙腈=70/30 0.01 mol/L dicarboxyl-acetonitril (V/V=70/30); b—0.01 mol/L的草酸溶液/乙腈/甲醇=79/10.5/10.5 0.01 mol/L dicarboxyl-acetonitril-methanol (V/V/V=79/10.5/10.5); c—0.01 mol/L的草酸溶液/乙腈/甲醇=76/19/5 0.01 mol/L dicarboxyl-acetonitril-methanol (V/V/V=76/19/5); d—0.01 mol/L的草酸溶液/乙腈/甲醇=76/16/8 0.01 mol/L dicarboxyl-acetonitril-methanol (V/V/V=76/16/8) .]

图2 加标土壤、 粪样的TCs色谱图Fig.2 Chromatograms of tetracyclines in spiked soil and manure samples[注(Note): A—土壤样品Soil sample; B—猪粪样品Swine manure sample; C—鸡粪样品Chicken manure sample.]

图3 不同提取液对土壤中TCs的提取效率Fig.3 Recoveries of tetracyclines extracted with different buffer solutions in soils[注(Note): A—0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine缓冲溶液 0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine buffer solution; B—0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine缓冲溶液/甲醇等体积混合 Equivalent volume mixture of 0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine buffer solution and methanol; C—0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine缓冲溶液与丙酮(含20%的0.01mol/L草酸甲醇)等体积混合Equivalent volume mixture of 0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine buffer solution and acetone (containing 20% of 0.01 mol/L dicarboxyl in methanol). 柱上不同字母表示不同提取液间提取效率在5%水平差异显著Different letters above the bars mean significant at the 5% level.]

2) 洗脱液的选择 本实验对比了0.01 mol/L草酸甲醇和丙酮(含20%的0.01 mol/L草酸甲醇)两种洗脱液的效果(图4)。前者的OTC、 TC和CTC回收率分别为96.0%、 90.8%和91.6%，后者的回收率分别为99.1%、 98.4%和91.3%，两者差异不明显。但是丙酮的极性比甲醇小，对腐殖质等有机物杂质的溶解性小[23]，可以减少土壤中有机质等杂质的干扰。且丙酮洗脱液浓缩所用的时间要明显少于前者，故选择丙酮(含20% 0.01 mol/L草酸甲醇)作为洗脱液。

图4 不同洗脱液的效果比较Fig.4 Recoveries of two styles of eluant[注(Note): 洗脱液1为0.01 mol/L草酸甲醇 Eluant 1 was 0.01 mol/L dicarboxyl in methanol; 洗脱液2 为丙酮(含20% 0.01 mol/L草酸甲醇) Eluant 2 was acetone (containing 20% of 0.01 mol/L dicarboxyl in methanol.)]

2.1.3 线性回归分析、 回收率以及检出限 配制系列浓度混合标准溶液，得3种TCs的响应面积(y)与浓度(x)均呈现出良好的线性关系(R2﹥0.999)，分别以3倍和10倍信噪比求得检出限和定量限，结果见表1。将0.5 mg/L和2.0 mg/L的标准溶液分别连续进样6次，3种TCs的保留时间和峰面积相对标准偏差(RSD)均在0.6%以下，重现性较好。

表1 3种TCs的线性回归分析、 检出限、 定量限和回收率

注(Note)： 土壤、 猪粪和鸡粪中OTC、 TC和CTC的加标浓度分别为10、 10和20 mg/L The spiking levels of OTC, TC and CTC in soil, swine manure and chicken manure are 10, 10 and 20 mg/L, respectively. LOD—Limit of Detection; LOQ—Limit of quantification.

2.2 土壤和有机肥样品的测定结果

利用上述优化后的分析方法，对天津市蔬菜种植基地的25个土壤样品及其附近9个规模化养猪(鸡)场的粪样和4种商品有机肥进行了检测。

表2 畜禽粪便和商品有机肥中TCs的残留情况

注(Note)： nd—未检出 Not detectable

在检测的4个商品有机肥样品中，有2个同时检测到3种TCs，2个检测到2种，OTC和CTC的检出率为100%，TC的检出率也在50%。OTC、 TC和CTC平均残留分别为2.6、 0.3和7.7 mg/kg，CTC的平均水平高于集约化养殖场的畜禽粪便中检测的中间值。

2.2.2 土壤调查结果 土壤调查结果见表3。从表3可以看出，3个很少施用有机肥的粮田土壤样品均未检测到抗生素的残留。22个菜田土壤样品中，有14个样品中检测到了不同程度的抗生素污染，检出率为64%。有6个样品TCs的总量超过欧盟规定的土壤抗生素残留的生态安全触发线(100 μg/kg)[26]。TC在8个菜地土壤中检出，最高残留量为196.7 μg/kg(风干基，以下土壤样品均为风干基); CTC在7个菜地土壤中检出，最高达到477.8 μg/kg; OTC在4个菜地土壤中检出，最高达到105.6 μg/kg。菜田土壤中3种抗生素的检出率大小顺序为TC(36%)>CTC(32%)>OTC(18%)。

从三种蔬菜栽培方式看，10个温室土壤样品有6个检测到TCs，检出率为60%; 6个大棚土壤样品中有4个检测到TCs，检出率为67%; 6个露地菜田土壤样品有5个检测到TCs，检出率为83%。TCs总量超过生态安全触发线的6个样品中有5个出自温室和大棚土壤，1个来自于露地土壤。

表3还显示， 菜地中的抗生素残留呈现一定的地域性，西青区辛口镇的7个样品中均检出TCs，而在其它几个镇的检出率就很低。但由于对具体施肥数量和来源调查不全，尚不能明确施肥数量和来源对土壤残留水平的影响。

3 讨论

3.1 优化分析方法的可靠性和实用性

3.2天津地区集约化养殖场产生的粪便中TCs残留状况

商品有机肥中的有机物料按照标准要求需经过严格、 充分的高温堆腐过程。高温堆肥可以有效去除畜禽粪便中的TCs，去除效率由大到小的顺序均为TC>CTC>OTC[30]。在天津调查的4个以集约化养殖场的鸡粪和猪粪为原料生产的商品有机肥样品中，依然检测出不同水平的TCs残留，OTC、 TC和CTC平均残留量分别为2.6、 0.3和7.7 mg/kg(干基)，OTC和CTC的平均水平高于集约化养殖场的畜禽粪便中检测的中间值，商品有机肥中的平均含量是TC

3.3 天津菜地土壤中的TCs残留状况

从三种蔬菜栽培方式看，TCs总量超过生态安全触发线的6个土壤中有5个出自温室和大棚，说明有机肥带入土壤中的TCs在环境中的降解和迁移是十分活跃的。虽然TCs一般被视为持久性有机污染物，可能会在土壤中持久存在，并随时间的延长而不断的累积[41]，但不同种植年限土壤中的TCs含量主要取决于当年或当季所使用粪肥中的残留状况。随着施用时间的延长，TCs会逐渐降解，或通过地表径流、 渗透、 挥发等过程迁移出地表土壤。露地栽培方式的土壤中TCs相对于温室和大棚栽培较高的检出率和较低的残留水平有可能是因为TCs在露地土壤中的迁移和降解稍逊而导致的长期积累。鸡粪和猪粪中残留的TCs的降解途径主要为化学水解，在TCs不稳定的A环手性原子C4和C环C6的羟基易发生差向异构和降解反应[42]。虽然有培养试验证明在鸡粪和猪粪培养前50 d左右，光照对OTC的降解率占了20%[31]，但在实际生产中，光照很难穿透5 cm以下的土层，因此，光降解不是主要途径。有机肥中可溶性成分可随水移动，因此，极性强的TCs在露地土壤上更容易在表土层内积累。不同栽培方式下，微生物在施肥初期由于抗生素抑制作用，对抗生素的分解贡献率很小，但随着时间的延长，微生物对抗生素的分解作用逐步加强。土壤中微生物活性越强，抗生素降解速度越快[38]。温室和大棚栽培条件下，全年温室内土壤温度较高，微生物的活性较高，对有机物的分解较快，吸附在有机质上的TCs被释放出来，进而被水解。而北方露地栽培在冬季、 早春土壤温度一般低于0℃，微生物的活性在此时很低，对有机质的分解能力因此减弱，TCs有可能得以吸附于有机质上而免于被水解或淋洗。而且温室、 大棚等设施菜地土壤的湿度一般比露地菜田的大，高温、 高湿条件下更有利与抗生素的降解[43]，因此，虽然露地栽培方式的有机肥用量一般低于温室和大棚，其TCs的检出率仍有可能高于温室栽培。

本项调查中菜田土壤中抗生素的残留没有随种菜年限的延长而增加，种菜时间较短的土壤上TCs的残留比种菜历史较长的地块严重。这可能与种植历史较长的土壤上产生了对TCs抗性较强的微生物有关[44-45]。此外，我国动物养殖过程中抗生素使用种类、 数量也由于管理水平和养殖规模存在随机性，天津的鸡粪和猪粪样品残留的抗生素没有显示出一定的规律性，因此，使用该有机肥的土壤中残留的TCs种类也没有显示出与不同来源有机肥样品的一致性。由于此项调查的土壤均来自随机选取的农田，有机肥来源、 有机肥质量以及种植作物个体性强，除了大体上看出抗生素的残留状况，尚不能得出施肥量、 有机肥种类以及施用时间与TCs残留之间的关系。因此，从源头上控制进入土壤的TCs总量才是防治TCs残留的最好方法。

3.4 有机肥的施用风险

目前，虽然已有一些关于TCs在畜禽粪和在土壤中降解特征的研究，但是有机肥-土壤-植物体系中抗生素的研究还不够系统，比如，由有机肥带入的抗生素与土壤中抗生素残留之间的关系; 不同抗生素残留水平下作物对抗生素的吸收情况; 畜禽粪肥施入土壤后给人类带来的健康风险以及有机肥的安全用量等方面还有待研究。

4 结论

2)天津集约化养殖场的畜禽粪中CTC检出率达到78%，中间值为6.4 mg/kg，最高值达到563.8 mg/kg; OTC和TC的检出率也高达56%，中间值分别为7.3和1.5 mg/kg，最高值达到34.8和22.7 mg/kg。

3)商品有机肥中同样存在TCs残留，且三种抗生素的残留水平和检出率与养殖场相当，商品有机肥的生态安全仍然是需要关注的。

4)天津土壤样品中TCs的总检出率为64%。三种抗生素中，OTC检出率最低(18%)，最高值达到105.6 μg/kg(风干基)，平均9.4 μg/kg; TC检出率为36%，最高值达到196.7 μg/kg，平均28.9 μg/kg; CTC检出率为32%，最高值达到477.8 μg/kg，平均48.9 μg/kg。有6个菜田土壤样品(占调查样品的27.3%)TCs总量超过生态安全触发线，存在一定的生态风险。

5)天津菜田土壤中的TCs的残留主要由畜禽肥带来。本调查土壤中抗生素残留未随种菜年限延长而增加，温室和大棚土壤的TCs残留水平高于露地土壤。

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OptimizationofresidualtetracyclinesanalysisinsoilsandmanureusingSPE-HPLCandpilotsurveyinTianjin

ZHANG Zhi-qiang1, LI Chun-hua1, HUANG Shao-wen1*, GAO Wei2, TANG Ji-wei1

(1InstituteofAgriculturalResourcesandRegionalPlanning,ChineseAcademyofAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofPlantNutritionandFertilizer,MinistryofAgriculture,Beijing100081,China;2TianjinInstituteofAgriculturalResourcesandEnvironment,Tianjin300192,China)

X53; S129

A

1008-505X(2013)03-0713-14

2012-10-17接受日期2013-02-03

现代农业产业技术体系建设专项(CARS-25-C-11); 公益性行业(农业)科研专项(201203095); 国家留学基金(2012-01)资助。

张志强(1985—)，男，山东寿光人，硕士研究生，主要从事肥料资源利用研究。E-mail:zzq551@qq.com *通信作者 Tel: 010-82108662, E-mail: huangshaowen@caas.cn