香菇多糖对氨磷汀处理Hela细胞生长的保护作用

欧阳晶，陈汝雪，牟 瑛

氨磷汀(amifostine，WR-2721)是一种细胞保护剂，对正常组织具有保护作用［1-2]。但是 WR-2721在一定的剂量时也具有一定的毒性作用［3-5]，临床上WR-2721的主要不良反应为低血压、过敏性皮疹、发热、休克和血钙降低等［6-7]。笔者的前期实验研究表明，多糖能减少WR-2721对体外细胞造成的毒性。本实验采用MTT法检测细胞的存活率，采用比色法测定细胞丙二醛(MDA，malonyldialdehyde)含量，流式细胞术检测细胞凋亡，以观察香菇多糖与WR-2721联合应用对Hela细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

Hela细胞株，由本院提供;香菇多糖，湖北创力药业有限公司;WR-2721，湖北葛店人福药业有限公司;DMEM(dulbecco's minimum essential medium)培养基，美国GIBCO公司;小牛血清，杭州四季青生物工程公司;MTT，PI，Sigma公司;MDA试剂盒，南京建成生物工程研究所;Triton X-100，Amersco公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 Hela细胞培养于含10%小牛血清DMEM培养基，在37℃，5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养至对数生长期。

1.2.2 香菇多糖对Hela细胞生长的影响 取对数生长期Hela细胞(3×104/ml)，接种于96孔培养板中，置37℃，5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养12 h，加入香菇多糖溶液，终浓度分别为0、25、125、250、500、1000、2000 mg/L，每个浓度设 4 个孔，继续培养48 h。小心弃去上层培养液，加入150μl以DMEM培养基配制的MTT溶液继续培养4 h，弃去上层培养液，加入150μl DMSO，振荡10 min，用酶标仪在570 nm处测定OD值。按下列公式计算细胞存活率。

细胞存活率(%)=(实验组OD值/对照组OD值)×100%

1.2.3 香菇多糖对WR-2721处理的Hela细胞生长的影响 细胞处理方法同1.2.2，设空白对照组、WR-2721组、香菇多糖 +WR-2721联合给药组。WR-2721终浓度为500 mg/L，香菇多糖的终浓度分别为 0、25、125、250、500、1000、2000 mg/L。

1.2.4 香菇多糖对WR-2721处理的Hela细胞MDA的影响 取对数生长期的Hela细胞，用DMEM培养液调至3×104/ml，接种于6孔培养板中。置37℃，5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养12～16 h，设空白对照组、WR-2721组及香菇多糖+WR-2721联合给药组，WR-2721终浓度为500 mg/L，香菇多糖终浓度分别为50、200、1000 mg/L，每个浓度设4个孔。继续培养48 h，用1.5 ml PBS吹打制成细胞悬液移入离心管，反复冻融3次，用超声细胞破碎仪在冰浴中完全破碎细胞(20 kHz，10 min)，4℃离心，取上清液，按试剂盒说明书测定MDA含量。

1.2.5 香菇多糖对WR-2721处理的Hela细胞凋亡的影响 取对数生长期的Hela细胞，以5×104/ml的密度接种，培养16 h后，设空白对照组、WR-2721组和香菇多糖+WR-2721联合给药组，WR-2721终浓度为500 mg/L，香菇多糖终浓度为125、1000 mg/L，继续培养48 h，胰酶消化成单细胞悬液，用冰PBS洗涤2次，800 r/min离心5 min，离心半径为85 mm，弃上清，缓慢加入－20℃预冷的70%乙醇，4℃过夜。取细胞悬液，PBS洗涤，1600 r/min离心5 min后，弃上清。PI染色液1 ml染色30 min，混合液经过300目滤网以除去杂质，流式细胞术测定细胞的凋亡率。

2 结果

2.1 香菇多糖对Hela细胞生长的影响

与空白对照组(多糖剂量为0)比较，各浓度的香菇多糖组差异均无统计学意义(P＞0.05)，提示香菇多糖对Hela细胞无明显不良作用。见表1。

表1 不同浓度香菇多糖对Hela细胞生长的影响(±s)

表1 不同浓度香菇多糖对Hela细胞生长的影响(±s)

多糖剂量(mg/L) 细胞存活率(%)0 100.0 ±1.3 25 99.8 ±1.6 125 100.8 ±3.8 250 98.9 ±1.3 500 104.8 ±3.0 1000 106.9 ±11.5 2000 100.0 ±2.3

2.2 香菇多糖对WR-2721处理Hela细胞生长的影响

WR-2721处理组Hela细胞存活率为41.4%，香菇多糖在1000、2000 mg/L时，Hela细胞存活率分别为63.0%和58.5%，与WR-2721组比较均非常显著升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。提示高浓度香菇多糖对WR-2721的细胞毒性有显著的防护作用。见表2。

表2 香菇多糖对WR-2721处理Hela细胞生长的影响(±s)

表2 香菇多糖对WR-2721处理Hela细胞生长的影响(±s)

注:与空白对照组比较a P＜0.01;与WR-2721组比较b P＜0.01

组别 WR-2721(mg/L)香菇多糖(mg/L)细胞存活率(%)空白对照组0 0 100.0 ±1.5 WR-2721 组 500 0 41.4 ±2.2a联合给药组 500 25 39.1 ±2.0a 500 125 41.5 ±2.1a 500 250 46.0 ±0.1a 500 500 41.1 ±4.6a 500 1000 63.0 ±2.4ab 500 2000 58.5 ±5.4ab

2.3 香菇多糖对WR-2721处理Hela细胞MDA的影响

不同浓度的香菇多糖溶液与WR-2721联合应用，与空白对照组及单用 WR-2721组比较，细胞MDA差异无统计学意义(P＞0.05)。提示香菇多糖、WR-2721及两者联合应用对Hela细胞的MDA含量均没有明显影响。见表3。

表3 香菇多糖与WR-2721联合使用对Hela细胞MDA的影响±s)

表3 香菇多糖与WR-2721联合使用对Hela细胞MDA的影响±s)

组别 WR-2721(mg/L)香菇多糖(mg/L)MDA(nmol/ml)空白对照组0 0 2.15 ±0.16 WR-2721 组 500 0 2.31 ±0.24联合给药组 500 50 2.21 ±0.31 500 200 2.17 ±0.32 500 1000 2.26 ±0.27

2.4 香菇多糖对WR-2721处理Hela细胞凋亡的影响

WR-2721处理后Hela细胞的凋亡率明显增加;不同浓度香菇多糖处理组细胞的凋亡率均明显低于WR-2721组，差异均有统计学意义(P＜0.01)。提示香菇多糖能抑制WR-2721引起的Hela细胞凋亡。见表4。

表4 香菇多糖与WR-2721联合使用对Hela细胞凋亡的影响±s)

表4 香菇多糖与WR-2721联合使用对Hela细胞凋亡的影响±s)

注:与空白对照组比较a P＜0.01;与WR-2721组比较b P＜0.01

组别 WR-2721(mg/L)香菇多糖(mg/L)凋亡率(%)空白对照组0 0 17.3 ±0.7 WR-2721 组 500 0 27.5 ±0.9a联合给药组 500 125 24.3 ±1.1ab 500 1000 23.5 ±0.6ab

3 讨论

WR-2721是一种辐射损伤防护剂，在临床上主要用于辐射损伤的治疗，也用作化疗、放疗的保护剂，但WR-2721本身有较强的毒性作用。本研究发现，以终浓度为500 mg/L的WR-2721处理Hela细胞后，细胞存活率下降至41.4%，凋亡率达27.5%，与对照组比较差异有统计学意义，说明一定浓度的WR-2721对细胞有毒性作用。

国内外大量研究表明，电离辐射可以诱导细胞发生凋亡和氧化损伤［8-10]。MDA是氧化损伤的经典指标，机体通过非酶系统作用于生物膜中的不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化反应，生成大量的代谢产物MDA，常用MDA来反映组织脂质过氧化损伤的程度，也用来评价辐射防护药物对机体的保护作用［11-12]。本研究显示，香菇多糖、WR-2721及两者联合应用均不会引起细胞产生脂质过氧化反应。

细胞凋亡在维持组织正常形态及功能方面起重要作用。香菇多糖浓度为125～1000 mg/L时，与WR-2721联合使用后，其凋亡率最低达19.8%，显示香菇多糖可显著减少WR-2721所致的Hela细胞凋亡，说明一定浓度的WR-2721对体外培养细胞具有明显的毒性，香菇多糖对WR-2721造成的细胞毒性具有防护作用。

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