抗体技术研究进展(2):小分子抗体及功能复合化抗体

向军俭， 童吉宇， 王 宏

(1.广东省分子免疫与抗体工程重点实验室，广东广州510632;2.暨南大学抗体工程研究中心，广东广州510632)

1 小分子抗体

由于抗体分子与抗原结合的部位仅局限于其可变区，若利用基因工程技术则可构建分子质量较小的、能与抗原结合的分子片段，这些小分子片段称为小分子抗体.小分子抗体具有以下优点:①可进行原核表达;②易于穿过血管壁或者组织屏障;③无Fc段，减少Fc受体带来的影响;④易于进行基因工程改造.

1.1 Fab

Fab是抗体发挥结合抗原作用的主要区段，由重链的CH1-VH和完整轻链组成，二者通过二硫键形成异二聚体，使得Fab结构较为稳定，且保留了天然抗体的Fv段结构.由于其不含Fc段、分子质量小、结合力高、抗原性低，故在肿瘤治疗中有其优越性，目前已有多个Fab片段药物获得FDA批准上市，如阿昔单抗(abciximab，ReoPro)［1］，该产品以血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa为靶点，用以防止血小板聚集及血栓形成，作为冠状动脉导管插术时预防心肌缺血的辅助用药，取得了巨大的成功;此外还有兰尼单抗(lucentis)［2］、赛妥珠单抗(cimzia)［3］等.

1.2 ScFv(single-chain Fv，单链抗体)

scFv是由VH和VL通过一条连接肽(linker)首尾连接在一起，通过正确的折叠，VH和VL以非共价键形式结合形成具有抗原结合能力的Fv，大小约为完整单抗的1/6，是目前证实的具有生物学功能的最小形式的抗体，由于ScFv的linker承担了维持VH和VL空间构象的功能，linker必须使重、轻链可变区自由折叠，从而使抗原结合位点处于适当的构型，不干扰VH和VL的立体折叠，并且不对抗原结合部位造成影响，保持亲本抗体的亲和力.在构建过程中，linker的长度是有限制的，为使Fv的立体结构变形，linker长度应不短于3.5 nm(10个氨基酸残基)，linker也不宜过长，以免对抗原结合部位造成干扰，研究表明，一般linker的长度选择在14～15个氨基酸残基左右比较合理.

目前应用最为广泛的linker是4个甘氨酸和一个丝氨酸复出现3次，即(GGGGS)3，其中甘氨酸是分子质量最小、侧链最短的氨基酸，可以增加侧链的柔性，丝氨酸是亲水性最强的氨基酸，可以增加 linker的亲水性，因此，这条 linker具有较好的稳定性和活力.此外，也可以设计不同长度和序列的 linker，构建具有不同生物学功能的 scFv.scFv可以在多种表达系统进行表达，如原核，酵母，植物，昆虫，哺乳类动物细胞等，但是最常用的是大肠杆菌.常用的表达方式有:以包含体或者非包含体性不可溶蛋白，此方法表达量高，但需要进行变性－复性等，使其正确折叠;分泌表达，即将细菌前导序列与scFv的氨基端连接起来，使其分泌到周质腔，并在其中完成二硫键的形成和正确折叠，此方法可直接表达有活性的抗体分子，但产量低;噬菌体展示表达，噬菌体展示技术将表型和基因型联系在一起，将识别相应抗原和进行再扩增的能力结合起来，不经人体免疫，绕过杂交瘤技术，通过几轮“吸附－洗脱－扩增”的体外筛选富集过程，即可得到人源的scFv［4］;核糖体展示技术完全在体外进行，库容量远远大于噬菌体展示文库，此外核糖体展示技术具有简便的建库和筛选方法，勿需选择压力，通过引入突变和重组技术来提高靶标蛋白的亲和力.上述优点都使核糖体展示技术显示出了诱人的发展前景.

通常scFv具有良好的结合活性，但有时比其亲本抗体亲和力低，且常显示聚集倾向，为改善这一缺点，有人在VH和VL间导入链间二硫键，构建了ds-Fv.通常在远离CDR的结构保守骨架区设计二硫键，迄今已有十多个dsFv见诸报道，与相应scFv相比，前者稳定性有明显提升，但抗原结合活性则有所不同，即有增强，也有下降和不变的，但是由于稳定性的提高，其结合能力的下降往往能得到补偿.1995年第一个scFv进入临床研究，2000－2008年其研发总数量占据了总研究项目数的44%，目前已有19种scFv进入临床研究，其中3种进入到Ⅲ期临床试验.迄今还没有scFv产品上市.在开发中取得较好效果的当属美国 Alexion制药公司的以补体C5为靶点的人源化 scFv——Pexelizumab(过去 5G1.1-SC)，该产品正处于冠状动脉旁路移植术使用的Ⅱ/Ⅲ期临床试验阶段［5］.

由于ScFv和dsFv具有分子小，穿透力强，廓清快，异源性低，易于大量生产等优点，故其在靶向载体，构建其他工程抗体(如多价小分子抗体)和细胞内抗体等方面具有乐观的应用前景.

2 双(多)价及双特异性抗体分子

2.1 双(多)价抗体分子

天然抗体分子至少是双价分子，而生物性抗原通常也是多价的，抗体的多个抗原结合部位与同一表面的多个重复抗原表位结合可以获得更高的亲和力，并且多价结合还可以引起与单价抗体不同的效果，如受体交联，激发细胞内信号传导，激活细胞或者诱导细胞的凋亡等生物学效应.近年来由于基因工程抗体技术的发展，将单价小分子抗体改建为双或多价抗体成为抗体工程中的一个重要领域.

通常构建双或多价抗体的方式有:体外交联构建双价抗体，通过自聚化结构域构建双或多价抗体，双链(diabody)及三链抗体(triabody).

体外交联构建双价抗体，主要是在小分子抗体的羧基端设计半胱氨酸残基，通过半胱氨酸氧化成二硫键或使用双顺丁烯二酰亚胺形成硫酯键使Fab或ScFv交联成为双价抗体分子.此方法由于操作较烦琐，所以应用得不多.

自聚化结构域构建双或多价抗体，是将具有自聚化倾向的结构域连接在单价小分子抗体的3'端，从而促使抗体分子片段多聚化.常用的自聚化结构有:①亮氨酸拉链，它是在一段肽链序列重复出现4～5个亮氨酸，每个亮氨酸间隔6个氨基酸残基，在α螺旋结构中表现为每两圈出现一个亮氨酸，且这些亮氨酸排列在螺旋的一侧，两个类似的结构可以通过亮氨酸残基间的疏水作用形成拉链式的结构，从而形成蛋白质双体.然而亮氨酸拉链间的结合并不十分牢靠，有相当一部分的抗体分子仍以单体形式存在，若在抗体分子羧基端再加上一个半胱氨酸，可形成链间二硫键而稳定双体分子.②α螺旋束，在天然蛋白中存在由反向平行的4个同样的α螺旋形成的紧密结构—4-α螺旋束，将此序列连接在小分子抗体的3'端，可形成多价抗体分子.应用较多的是以β转角将两个α螺旋连接成螺旋—转角—螺旋结构.此结构中的4个螺旋束中的疏水面暴露的较少，且反向平行结构使两个抗原结合部位可以同时结合相距较远的抗原表位，故此结构性能优于亮氨酸拉链.③免疫球蛋白功能区，在天然Ig分子中，两重链的CH3区相互作用形成紧密的球状结构.将CH3连接于ScFv羧基端，表达的融合蛋白可在胞内自动二聚化成二聚体，称为minibody，其分子质量在80 000左右，在体内有较长的半衰期，在肿瘤治疗中有较好的前景.④链亲和素，链亲和素是一个稳定的同源四聚体蛋白，其与生物素具有很高的结合力，从而可用于构建多价抗体.将ScFv连接于链亲和素的N段，可在大肠杆菌中表达出四价小分子抗体，由于外源性较强，故大多用于体外检测.在自聚化倾向的结构域和抗体分子间需要设计一条柔性接头，常用的有(GGGGS)3接头、人或鼠IgG3的铰链区;自聚化结构尾部可加上半胱氨酸，形成二硫键以增加稳定性.

双链抗体及三链抗体，在大肠杆菌表达SvFc的时候，发现不同的SvFc分子间VH和VL可以配对，形成双体.在此基础上，通过基因改造缩短SvFc的接头，使得两个不同的SvFc配对，以非共价键结合成二聚体，称为双链抗体［6］.后来，又有人引入了链间二硫键，以稳定双链抗体结构.在实验中发现，缩短接头不仅可以形成双链抗体，还可以形成三链甚至四链抗体分子.Hudson实验室以抗神经氨酸酶ScFv作为模式研究发现，用缩短接头的方法制备多价抗体时，不同抗体因其立体结构差别而显示出不同的规律，从而显示出明显的个性.对同一单链抗体所构成的具有不同结合价的小分子的结合价数与功能亲和力关系进行评估发现，四价、二价和单价分子的功能亲和力比值约为140∶20∶1，又对分子质量大小与药物动力学关系的研究显示:双链抗体和minibody迄今显示了最好的肿瘤靶向、肿瘤组织穿透力和血液清除率，成为最具潜力的免疫治疗载体.

2.2 双特异性抗体(Bispecific antibody，BsAb)

双特异性抗体［7］指具有两个抗原结合部位，分别识别两个不同的抗原表位的双链抗体.结合抗原的结合臂可分别来自Fv段、Fab段、scFv、dsFv等.

双特异性抗体可以通过化学、细胞工程及基因工程方法构建.

化学方法构建是指使用化学交联剂将两个完整的免疫球蛋白或其抗原结合臂F(ab')2片段连接起来而得到双特异性抗体.由于该方法易产生同源性双抗，纯化步骤复杂，产物不稳定，且容易失活，因此目前很少再利用该技术制备双特异性抗体［8］.

细胞工程双特异性抗体的生产体系，主要是用细胞融合的方法通过三体杂交瘤或四体杂交瘤，前者以分泌特定单抗的杂交瘤细胞和免疫后的淋巴细胞作为亲本细胞进行融合，后者是由分泌不同单抗的两种杂交瘤细胞进行融合所获得，该方法可以获得具有完整抗体分子结构的双特异性抗体.但是由于两种重轻链在细胞内随机组合可产生10种不同分子数的不同的抗体分子，使得制备过程效率低，费用高，使四源杂交瘤技术不再受到人们的青睐，但是这里有个特例，三功能单抗(triomab)，这种抗体是由分泌不同单克隆抗体的大鼠杂交瘤细胞和小鼠杂交瘤细胞融合所形成的四源杂交瘤细胞产生，其一条臂靶向肿瘤细胞上表达的抗原，另一条臂靶向T细胞上的CD3分子，并且其杂交Fc片段能有效与人类Fc受体结合，可有效募集巨噬细胞和NK细胞，增加肿瘤杀伤效应.其唯一缺点是免疫原性强，不利于大量反复注射，所幸的是该类药物低剂量就可发挥较强的抗肿瘤效应.

其中比较重要的TriomAb有3种:Catumaxomab是最早的TriomAb，能够靶向表皮细胞黏附因子(EPCAM)［9］和 CD3，前者是一个重要的肿瘤标志物.2009年，Catumaxomab经欧盟委员会审批用于表皮细胞黏附因子阳性的恶性腹水、卵巢癌、胃癌的治疗;Ertumaxomab［10］靶向人 的表 皮生 长因 子 2(HER2)和CD3，HER2是很好的乳腺癌标志物，与之前作为靶向HER2的单抗药物trastuzumab相比，Ertumaxomab 在临床上更为高效;Bi20［11］，具有与前两者相同的Fc片段，且靶向CD20，目前处于临床Ⅰ期，用于B细胞恶性肿瘤的治疗，其对非霍奇金淋巴瘤的治疗效果比rituximab更好.

随着抗体基因工程技术和宿主载体表达系统的进展，新型的重组BsAb技术应运而生，其经典模式是将 ScFv、双链抗体(diabody)或微抗体(minibody)串联而成.近期 Michaelson等［12］将抗 LTβR的ScFv片段融合于抗TRAIL-R2单抗的重链端，设计的以TNF家族膜受体TRAIL-R2和LTβR为靶点的BsAb.该抗体在体内、外实验都能对肿瘤细胞有良好的抑制效果;Ryutaro等［13］通过人鼻病毒3C(human rhinovirus 3C，HRV3C)蛋白酶识别位点，将双特异性双链抗体hEx3-ScDb(以EGFR和CD3为靶点)融合到人Fc区域，合成IgG样BsAb的抑制肿瘤的效果明显优于已批准上市的西妥昔单抗.

基因工程方法主要通过自聚化结构和双特异性双链抗体(bispecific diabody)构建双特异性抗体.

利用自聚化结构构建时，为避免相同特异性分子之间的配对，需对自聚化结构域进行选择或者改造，如转录因子fos和jun亮氨酸拉链倾向形成二聚体，若将这两种亮氨酸拉链序列分别与不同特异性的小分子抗体的羧基端融合，可得到双特异性抗体.

双特异性双链抗体(bispecific diabody)是将两个不同特异性抗体的轻重链可变区交叉组合，即其中一条链含有A抗体的VH和B抗体的VL，另一条链由A抗体的VL和B抗体的VH组成，这两条链可以形成双特异性双链抗体.此方法构建的抗体，分子质量较小，易于穿透肿瘤组织，结构简单易于构建，展示了极为良好的应用前景，是目前最具吸引力的构建双特异性抗体的方法.

3 抗体融合蛋白

抗体融合蛋白是指将抗体分子片段与功能性的蛋白融合，从而获得具有多种生物学功能的融合蛋白.根据所利用的抗体分子片段不同，可将抗体融合蛋白的构建方式分为两大类.一类是将抗体Fv段与其他生物活性蛋白融合［14］，利用Fv段的特异性识别功能将功能性蛋白靶向到特定部位，主要应用范围有:免疫靶向，免疫桥连和嵌合受体.

3.1 免疫靶向

免疫靶向主要是将毒素、酶、细胞因子等生物活性物质与抗体融合，从而将这些生物活性物质靶向到特定的部位，有利于其生物学功能的发挥，并且减低其毒副作用，其最主要的应用领域是恶性肿瘤的靶向治疗.

(1)免疫毒素 将针对肿瘤细胞特异表达的膜分子的抗体与毒性蛋白融合称为免疫毒素［15］.目前使用的毒素大多需进入细胞内起作用，常用的有细菌来源的毒素，如绿脓杆菌外毒素、白喉毒素和植物来源的毒素，如蓖麻毒素、皂草素［16］等，为了避免这些毒素杀伤正常细胞，在构建免疫毒素时应删除细胞结合区，如现在常用的PE38等，即为除去细胞结合区的毒素.

(2)免疫细胞因子 许多淋巴因子能够激活免疫系统，诱发抗肿瘤免疫反应活性，但是全身应用时毒副作用明显，从而限制了其临床应用.将抗体片段与细胞因子融合，可将这些细胞因子靶向到肿瘤部位而发挥抗肿瘤作用，同时减少全身毒副作用，这类融合蛋白称为免疫细胞因子，目前与抗体融合的细胞因子包括:IL-2、IL-12、TN F及GM-CSF等.抗神经节苷脂抗体 ch14.18与重组人肿瘤坏死因子B(rTN F-B)的融合蛋白，是最早问世的抗体——细胞因子融合蛋白，临床Ⅰ、Ⅱ期试验结果表明，该融合蛋白的治疗能显著延缓肿瘤的复发，延长患者的生存期，且效果优于等量抗体和rTN FB联合应用，显示了靶向性细胞因子的独特优越性及良好的应用前景.

(3)与蛋白酶融合 纤维蛋白溶酶原激活物可以激活纤维蛋白溶酶反应活性，溶解血栓.通过将抗纤维蛋白的单链抗体与纤维蛋白溶酶原激活物基因融合，可以有效的将纤维蛋白溶酶原激活物定位于血栓形成部位，促进血栓溶解.另外，抗体与酶的融合也可用于抗体导向的酶－前药治疗，将酶与抗体融合后定位于肿瘤局部，再利用酶的活性，对给予的无细胞毒性的前药进行催化，转换成有细胞毒性的药物，从而达到杀伤肿瘤的目的.此方法由于其强选择性、酶促反应的放大效应、所用药物多为小分子化合物等而具有极大的临床应用潜能［17－18］.

(4)与超抗原连接 近来小分子抗体与超抗原的连接成为一个热点，如T细胞超抗原葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A，SEA)等.目前有多个Fab-SEA融合蛋白正在进行临床试验，如针对大肠癌的C215Fab-SEA、结肠癌的C242 Fab-SEA等.

3.2 免疫桥连

抗体分子与另一特异性靶向分子融合，构建可以同时结合效应细胞和靶细胞的融合蛋白，从而达到免疫治疗的目的.如将抗CD3的抗体与表皮生长因子(EGF)基因进行拼接形成融合蛋白，可将表达有CD3的T细胞与带有EGF受体的肿瘤细胞连接起来，介导T细胞杀伤效应.

3.3 嵌合受体

免疫系统杀伤肿瘤的主要途径是细胞免疫，杀伤性T细胞可以穿透瘤组织，对肿瘤细胞进行杀伤，然而抗体却不易穿透瘤组织，从而无法有效的对肿瘤细胞进行杀伤.嵌合受体是指将抗体的抗原识别部分与特定细胞膜表面蛋白分子融合，形成的融合蛋白表达于细胞表面，该融合蛋白既可利用抗体部分结合抗原，接受刺激信号，又可以通过膜蛋白部分传导信号至细胞内，引起细胞活化，产生特定的生物学效应［19］.如 T细胞表面表达嵌合抗体(T-body)，抗体与肿瘤细胞的结合可以激活T细胞杀伤肿瘤细胞或释放淋巴因子.但是考虑到肿瘤病人的T细胞可能存在TCR通路的缺陷等，所以T-body的应用还有待进一步发展.

另一类是将抗体Fc段与其他蛋白融合，利用Fc段所特有生物学功能与某些具有黏附或结合功能的蛋白融合，称为免疫黏附素.此融合蛋白中，Fc的主要功能是:增加融合蛋白在血液中的半衰期;将Fc的生物学效应如ADCC、调理作用等靶向到特定的目标;用于融合蛋白的纯化和检测.

4 纳米抗体

1993年Hamers等［20］报道了在骆驼血液中，有一半抗体天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)，克隆其可变区可以得到只由一个重链可变区组成的单域抗体—VHH(variable domain of heavy chain of heavychain antibody)，由于其晶体结构呈椭圆形，直径2.5 nm，长4 nm，所以又称为纳米抗体(nanobody，Nb)［21］.研究表明，这种新型抗体不仅存在于单峰驼，也存在于其他骆驼科动物——双峰驼、美洲驼、羊驼、骆马和小羊驼.

4.1 纳米抗体的结构和功能

纳米抗体的相对分子质量为15 ku，为普通抗体的十几分之一，这使它比普通的抗体分子更容易接近靶目标表面的裂缝或者被隐藏的抗原表位，所以它可以识别很多普通抗体所不能识别的抗原.研究发现虽然 VHH与人抗体重链 VH结构相似，但VHH的CDR1和CDR3比人抗体VH的长，这在一定程度上弥补了由于轻链缺失而造成的对抗原亲和力的不足，在CDR3形成的凸行结构可以更好地和抗原表位的凹形结构相结合，从而提高了Nb抗原特异性与亲和力［22］.

由于Nb是单域抗体，没有普通抗体中的连接肽所具有的连接肽，并且其在内部形成二硫键，所以Nb分子结构比较稳定.在苛刻的条件中，如胃液和内脏中仍保持抗原结合活性，这为口服治疗胃肠道疾病提供了新思路，另外在强变性剂存在条件下，Nb也不容易变性或变性后也容易复性;传统抗体的轻、重链相互作用区的大量疏水残基在Nb中被亲水残基所取代，所以Nb具有很好的水溶性，并且能有效地穿过血脑屏障，这有利于Nb进入一些致密组织发挥作用;Nb由于没有传统抗体的FC段，从而可以有效地避免FC段引起的补体效应;研究发现Nb的VHH与人VH3基因高度同源，在CDR3长度和VHH表面10个氨基酸与人的VH不同，因此可对VHH进行简单的改造使其人源化;此外由于Nb的分子质量小、结构简单，所以很容易在微生物中大量表达，以供建立抗体库或者筛选.

4.2 纳米抗体的种类和应用

与传统的小分子抗体类似，结合基因工程技术和抗体库技术［23］，可对单价抗体进行改造，转变为多种形式、有特殊功能的分子用于疾病的诊断和治疗.如多价［24］和多特异性纳米抗体［25］、“融合”纳米抗体［26］等都是利用了纳米抗体结构简单，溶解性好，稳定性好且能与抗原特异性高亲和力结合的特性.

(1)单价纳米抗体 通过从免疫或非免疫驼科动物体内分离出重链抗体，克隆其可变区用于构建单价Nb抗体库.再用相应抗原进行筛选，可以得到抗原特异性的Nb.由于Nb能与细菌或病毒表面特异性抗原结合，从而中和或封闭这些抗原，起到一定治疗作用;此外由于Nb的分子质量和分子大小与毒液中的毒性化合物很相似，因此预测它们有类似的生物分布特点，故能用于中和毒素，如 Hmila等［27］研制的可中和蝎子毒素 Aa-hI’的特异 Nb，用于中毒后血清治疗;Krüger等［28］克隆出抗变形链球菌的NbS362-VHH，通过给小鼠口服此抗体，可有效减少平滑面龋病的发生;目前人们还在研究抗HIV膜蛋白的Nb，希望能对HIV起到中和作用;Nb分子质量小、稳定性高、特异性强，且不易聚集的特性使其应用于阿尔茨海默症、帕金森病等淀粉样变疾病成为可能.

(2)多价和多特异性纳米抗体 多价抗体可以识别多个同种抗原表位，比单价抗体具有更高的亲和力;而多特异性抗体可以同时识别不同抗原表位，比单价抗体具有更强的抗原识别能力，多价和多特异性抗体在免疫诊断和治疗上有许多实用性.在前面所述的以ScFv构建多价和多特异性抗体中，由于分子结构较复杂，分子质量大导致其表达水平低、容易聚合和被蛋白水解，从而限制了大规模的临床发展.而纳米抗体具有严格的单域性质，高水溶性和稳定性，所以构建的多价和多功能抗体能在生物系统中高表达，且完全保留原有的功能，这为新型多价和多功能抗体的研究提供了思路.如双价NbLX-0081作为一种新型抗血栓药，可靶向结合在凝血连锁反应早期的血管假性血友病因子.这种双价复合物既能止血，又能选择性地阻止血管中不必要的血栓的形成，目前已成功通过一期临床实验;Harmsen等［29］构建了能结合猪Ig分子和手足口病毒的双特异性Nb，这种抗体在动物实验中能明显减轻动物的病毒血症.

(3)“融合”的纳米抗体 Nb严格的单体特性及仅15 ku的大小，使其成为利用基因工程构建融合分子的有效载体.将酶、抗菌肽、显影物质及延长其半衰期的物质与纳米抗体的基因融合可产生同时具有Nb特性和其他特定生物学活性的新融合蛋白.如通过基因技术VHH和寿命较长的分子融合在一起，可以提高 Nb在血液中的存在时间，弥补Nb半衰期短这个缺陷;将β内酰胺酶和识别肿瘤标记物的VHH融合在一起，可制成抗体依赖的酶前体药物;将抗菌肽和特异性Nb结合，可杀死特异的细菌而不引起体内正常菌群的紊乱;Delanote等［30］用来自骆驼的抗L-plastin纳米抗体作为效应器，通过阻断相关蛋白的功能(阻断 F-肌动蛋白捆绑，从而抑制PC-3细胞形成伪足)，实现无需操作基因的表达即可敲除结构蛋白的功能，弥补了RNAi依赖表型变化来判断沉默效果的缺陷:用Nb的靶向性、特异性以及极强的穿透能力，通过改变造影剂外壳成分或外壳上连接针对组织特异性抗原的抗体或特异受体的配体，可构建针对特定组织的靶向超声造影剂［31］，如连接有绿色荧光蛋白和Nb的复合物，通过靶向结合到活细胞，可用于疾病的诊断.

5 小分子抗体技术及应用比较

基因工程小分子抗体独特的结构特征使其具有多样化的功能特点，也为利用各种来源的蛋白结构域开展重组生物疗法提供了更开阔的思路.目前，基于基因工程小分子抗体的治疗学以肿瘤、免疫性疾病和感染性疾病为3大主要研究领域，大多数尚处于临床开发的阶段，其抗体药物的安全性和有效性还有待确定.表1中列举了数种基因工程小分子抗体的结构、功能、技术难度、应用及研究状况.

表1 基因工程小分子抗体结构、功能、技术难度、应用及研究状况Table 1 The structure，function，technical difficulties and application of gene-engineering smallmoleullar omtibodies，and It′s research progress

6 展望

自单克隆抗体技术建立以来，单抗在靶向治疗领域取得了巨大的进展，但局限性明显，主要表现在:单抗结构复杂，使其难以到达组织深处的靶点;体积大，渗透性差，给药途径有限;活化T细胞和激活免疫系统的能力低;人源化过程复杂，价格昂贵且难以大规模生产.

随着基因工程技术的发展，小分子抗体的研究逐渐成为热点.小分子抗体由于分子质量小、体积小、无Fc结构域等性质而使其在许多方面的表现优于单抗，如当其用于人体时不易产生HAMA反应;很强的组织渗透性;更容易与抗原的隐藏表位结合;可以通过微生物制备获得，程序简单，生产成本低;用于免疫诊断成像时，由于其不结合具有Fc受体的非靶细胞，因此显像清晰，本底低.然而，小分子抗体不能诱导由Fc结构域(fragment of crystallization)介导的效应功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)或补体依赖的细胞毒作用(complement dependent cytotoxicity，CDC)，短的半衰期也可能妨碍抗体药物在靶点的累积;部分类型抗体片段由于轻重链可变区以非共价键结合，连接肽呈现疏水性，常常显示聚合倾向，有可能形成不符合临床用药要求的聚合物，因而不如单抗稳定;此外，Fab的表观亲和力较低一直是Fab研究中的一个难题;由于合成方法的局限性，设计出稳定性好、功能强、纯化简单且利于生产的BsAb始终是其有待努力的发展方向;免疫毒素中毒素部分的免疫原性和导致的血管渗漏综合征等非特异性毒性严重限制了免疫毒素的临床应用.

目前，基于小分子抗体的研究主要应用于肿瘤、免疫性疾病和感染性疾病等领域，尽管大多数尚处于临床开发的小分子抗体药物的安全性和有效性还有待确定，但随着工艺技术的进步以及目前靶向治疗的发展，我们相信，小分子抗体的研究将在生物治疗和诊断领域具有广阔的应用前景!

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