大孔吸附树脂分离纯化Pneumocandin B0的研究

谢新宇，孔 鹏，冷 凤，张 炜

（微生物药物国家工程研究中心 河北省工业微生物代谢工程技术研究中心华北制药集团新药研究开发有限责任公司，河北 石家庄050015）

卡泊芬净（Caspofungin）是一种广谱抗真菌药物，由美国Merck公司开发，2001年上市[1］。卡泊芬净的作用机制是非竞争性地抑制真菌细胞壁的β－（1，3）－D－葡聚糖的合成，从而破坏细胞壁的完整性，最终导致真菌细胞溶解、死亡[2］。该药物对于临床常见的念珠菌属和曲霉菌属均有良好的抗菌效果，同时由于其特殊的作用机制，该类药物还具有较高的安全性[3］。

天然产物Pneumocandin B0（PB0）经侧链修饰后得到的环状六肽母核是合成卡泊芬净的主要原料，PB0分子式为C50H80N8O17，分子量1065.21，结构式见图1[4］。目前关于PB0分离纯化的报道较少，提取工艺较为复杂。作者采用大孔树脂吸附法提取分离发酵液中的PB0，效果较好。

图1 Pneumocandin B0结构式Fig.1 The structural formula of Pneumocandin B0

1 实验

1.1 试剂与仪器

PB0发酵液，华北制药新药研发中心；PB0标准品，自制。

大孔吸附树脂 XAD－4、XAD－1600，罗门哈斯公司；LX－18、LX－20，西安蓝晓科技有限公司；HZ801、HZ818、HZ820、HZ841，上海华震科技有限公司；乙腈（色谱纯），美国Merck公司；乙醇（工业级），沧州兴隆化工有限公司；去离子水，自制；其它试剂均为国产分析纯。

高效液相色谱仪，Shimadzu公司；搅拌器，上海司乐仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 树脂的预处理与再生

预处理方法：树脂用乙醇充分浸泡24h以上，期间间歇搅拌（除去树脂表面制孔剂、色素、杂质等），之后用大量去离子水洗至洗涤液加水不再产生白色浑浊为止；再用4BV 1mol·L－1NaOH 溶液搅拌浸泡4h（除去酸性物质），用去离子水洗至中性；再用4BV 1mol·L－1HCl溶液搅拌浸泡4h（除去碱性物质），用去离子水洗至中性。

再生方法与预处理方法基本相同。

1.2.2 发酵液预处理

PB0发酵液经真空抽滤后用去离子水洗涤，得到菌丝体；菌丝体用2BV乙醇搅拌浸泡3h，真空抽滤，得到PB0浸提液；浸提液加去离子水调至乙醇体积分数为30%，HPLC检测其纯度为13.3%。

1.2.3 树脂静态吸附量与解吸收率的测定

称取8种预处理完毕的大孔吸附树脂各2g（为滤干后湿重，下同），置于250mL锥形瓶中，分别加入PB0浸提液150mL，常温低速搅拌3h，过滤，检测滤液中PB0的质量浓度；取过滤后树脂加入150mL乙醇，在相同条件下进行解吸，检测解吸液中PB0的质量浓度。根据式（1）、（2）计算树脂对PB0的静态吸附量和解吸收率：

式中：Q为树脂静态吸附量，μg·g－1；ρ0为原液质量浓度，μg·mL－1；ρ1为吸附残液质量浓度，μg·mL－1；V1为加样体积，mL；m 为树脂质量，g；D 为解吸收率，%；ρ2为解吸液质量浓度，μg·mL－1；V2为解吸液体积，mL。

1.2.4 树脂静态洗脱实验

称取预处理好的5份HZ818树脂各2g，置于250mL锥形瓶中，加入过量PB0浸提液吸附至饱和，过滤。取滤干树脂分别加入150mL 30%、40%、50%、60%、70%乙醇，常温低速搅拌3h，过滤，检测洗脱液中PB0的质量浓度，根据式（2）计算不同体积分数乙醇对HZ818树脂的解吸收率。

1.2.5 树脂动态解吸实验

取预处理好的3份HZ818树脂各200mL，湿法装入3根玻璃柱（Φ∶H＝1∶7）。取同一批号的PB0浸提液上样，上样流速为200mL·h－1（即1BV·h－1），HPLC检测流出液浓度，当柱出口PB0浓度接近上样液浓度10%时停止上样，取600mL40%乙醇按相同流速洗柱。3根树脂柱分别用75%、85%、95%乙醇解吸，解吸流速控制为100mL·h－1（即0.5BV·h－1），解吸液每50mL（即0.25BV）收集为一瓶，HPLC监测解吸液PB0含量。合并收集PB0浓度大于100μg·mL－1的解吸液，用HPLC峰面积归一化法测定纯度。

1.3 色谱条件

色谱柱：Hypersil C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为乙腈－水 （50∶50，体积比）；流速1.0mL·min－1；柱温40℃；检测波长210nm；进样量10μL。

2 结果与讨论

2.1 树脂的选择

8种大孔吸附树脂的静态吸附量和解吸收率见表1 。

表1 8种大孔吸附树脂的静态吸附量和解吸收率Tab.1 Static adsorption amount and desorption yield of eight kinds of macroporous adsorptive resins

由表1 可以看出，HZ818树脂对PB0的静态吸附量和解吸收率最高，分别达10 436μg·g－1和95.3%，表明其可以很好地分离PB0。故选取HZ818树脂作为吸附树脂进行后续实验。

2.2 洗脱条件的选择

洗脱剂是影响大孔吸附树脂吸附分离的重要因素，不同洗脱剂对于大孔吸附树脂有不同的溶胀度，洗脱液中各溶质的组成也有所不同。以不同体积分数乙醇进行HZ818树脂的洗脱，解吸收率见图2。

图2 不同体积分数乙醇的解吸收率曲线Fig.2 Yield of static desorption with different volume fractions of ethanol

由图2可以看出，70%乙醇对PB0有较好的洗脱效果，故可选用70%以上乙醇作为解吸剂；50%乙醇洗脱会造成PB0较多的损失，影响解吸收率；40%乙醇的PB0解吸收率仅有2.3%且洗脱液呈浅黄色，HPLC检测其中含有较多杂质，是比较理想的杂质洗脱剂。故树脂吸附饱和后先用40%乙醇洗脱部分色素和极性较大的杂质，再用较高体积分数乙醇解吸。进行动态解吸实验，不同体积分数乙醇的解吸效果比较见表2 。

2.3 解吸条件的确定

表2 不同体积分数乙醇解吸效果比较Tab.2 The comparison of desorption efficiencies of ethanol with different volume fractions

由表2 可以看出，75%乙醇解吸不完全，拖尾较严重，不适合作为解吸剂；85%、95%乙醇解吸基本不拖尾，而95%乙醇解吸收率比85%乙醇虽略有提高，但其解吸液色谱纯度较85%乙醇解吸液明显下降，溶液色度也较深，这说明当乙醇体积分数过高时，大量的杂质一同被解吸下来。综合考虑，宜选取85%乙醇作为解吸剂。

3 结论

研究了用大孔吸附树脂从发酵液中提取Pneumocandin B0的工艺条件。从8种大孔吸附树脂中筛选出的大孔吸附树脂HZ818可以很好地分离PB0，静态吸附量达10 436μg·g－1。用 HZ818树脂柱吸附饱和后，先用40%乙醇洗涤、再用85%乙醇解吸，解吸收率达到91.6%，PB0浓度富集20倍以上，色谱纯度由13.3%提高至78.6%，为后续的精制工艺奠定了基础。该吸附－洗涤－解吸工艺简单易行、成本低、环保，适合工业化生产。

[1]李岷，沈永年，吕桂霞，等.棘白菌素类抗真菌药[J］.中国真菌学杂志，2009，4（4）：249－256.

[2]Denning D W.Echinocandin antifungal drugs[J］.Lancet，2003，362（9390）：1142－1151.

[3]Deresinski S C，Stevens D A.Caspofungin[J］.Clin Infect Dis，2003，36（11）：1445－1457.

[4]滕云，陈正杰，郑玲辉，等.棘白菌素类抗真菌药物的结构与微生物合成[J］.中国医药工业杂志，2010，41（10）：776－782.