aFGF特异性结合噬菌体的筛选与鉴定

黄 霞，谢瑞敏，严 峰

（海南大学 海洋学院，海南 海口 570228）

自从于1940年发现成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors，FGFs）后，经过半个多世纪的不断认识和探究，现已初步了解其作用机制.FGFs是由23个成员组成的蛋白质家族（FGFl～FGF23[1]）.酸性成纤维细胞生长因子（acid fibroblast growth factor，aFGF），即FGF1，大量存在于肾脏和脑组织中[2].aFGF的生理功能和生物学效应丰富多样，尤其在促进机体的生长发育、修复组织的损伤等方面发挥重要作用.研究表明，aFGF具有促进肿瘤细胞增殖的作用，在肿瘤组织的细胞表面表达丰富，和肿瘤的发生和发展具有密切关系[3-9].所以，我们可以从筛选aFGF拮抗肽入手，为肿瘤治疗提供新的途径.

噬菌体展示技术（phage display technology，PDT）是在1985年由Smith[10]创建，在逐步完善的基础上，因为其高效、简便的优势而被广泛运用于生物医药领域.它是通过将靶标蛋白包被固相载体后，从噬菌体肽库中筛选出特异性结合的短肽，并通过测序和合成用于新药研究.由于FGFs具有广阔的应用前景，为了得到其有效的抑制短肽，噬菌体展示技术提供了新的途径.其中，Fan等[11]用噬菌体15肽库，以固相包被的aFGF为靶标，筛选得到的15肽，其中的SSG和VPS基序与FGFR1相同.经一系列实验证明，其能够有效的抑制aFGF促进细胞的增殖.而用噬菌体7肽库筛选，与15肽库筛选相比较，具有：特异性更高、空间位阻更小、体内稳定性高、穿透肿瘤组织的能力强以及免疫源性低的优点.因此，我们用噬菌体7肽库，以固相包被的aFGF为靶标，筛选aFGF的结合肽，并进行了初步的研究鉴定，可为抗肿瘤新药提供重要基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

噬菌体七肽库（Ph.D.-7TMPhage Display Peptide Library）、E.coli ER2738均购自New England BioLabs公司.噬菌体筛选和扩增以及滴度测定、基因组的抽提参考NEB使用手册.HRP-抗M13抗体为Amersham Pharmacia公司产品.辅助噬菌体vcsM13购自Biovector.人aFGF购自Sigma公司，Balb/c 3T3细胞株由本研究室保存.

1.2 实验方法

1.2.1 aFGF结合肽的筛选

将aFGF用0.1 mol/L pH 8.6的NaHCO3溶液稀释后，包被96孔酶标板，4℃轻微震荡，孵育过夜.次日，倒掉板中的包被液，加满封阻液，4℃作用2 h.再用TBST（TBS+0.1%[v/v]Tween-20）缓冲液快速洗板6次.加入用TBST稀释的原始噬菌体肽库结合2 h后用TBST洗板10次.再用非特异性缓冲液Glycine-HCl洗脱 10 min，用 1 mol/L Tris-HCl（pH 9.1）中和洗脱液.取1 μL测滴度，剩的洗脱液全部扩增用于下一轮筛选.每轮逐步减少aFGF的包被量和结合时间、提高吐温浓度以及洗板时间，重复4轮淘选.

1.2.2 鉴定aFGF特异性结合噬菌体克隆及测序

将aFGF用NaHCO3溶液稀释后，包被96孔酶标板过夜.次日，倒去包被液，封闭液封闭2 h.用1×TBS/Tween洗板6次，Tween浓度与第四轮筛选步骤中所用浓度相同.加入噬菌体孵育，TBST洗脱后加入HRP-抗M13抗体，孵育1 h，TMB避光显色，H2SO4终止反应，酶标仪（318-MC型，上海高科技仪器有限公司）450 nm测OD值，空白对照.挑取阳性克隆，按照NEB使用手册进行扩增.以5'-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3'为测序引物，送华大基因公司测序.

1.2.3 aFGF竞争抑制实验

用aFGF稀释液包被96孔酶标板，4℃过夜.次日去包被液加封闭液，4℃静置封闭l h后TBST洗脱.将aFGF依次稀释为40、20、10、5、2.5、1.25 μg·mL-1，然后与阳性噬菌体克隆室温孵育.再将二者结合液加到96孔板中竞争结合.每个浓度设3个复孔，以野生型vcsM13噬菌体做对照.TBST洗脱后加入HRP-抗M13抗体，孵育1 h，TMB避光显色，H2SO4终止反应，酶标仪450 nm测OD值.

1.2.4 先导肽对aFGF诱导的Balb/c 3T3细胞增值的影响

在96孔酶标板中按每孔6000个细胞的密度加入Balb/c 3T3细胞，24 h后加入150 μL含0.4%血清的DMEM培养液，37℃5%CO2饥饿培养24 h.将稀释的阳性噬菌体与aFGF混合物加入，每种样品设4个稀释度各3个复孔.以vcsM13噬菌体做对照.继续培养48 h后加入20 μl MTT，再培养4 h.加入DMSO终止反应，30 min后，570 nm测OD值.

2 结果

2.1 特异性噬菌体的筛选与富集

通过四轮筛选，与aFGF结合的噬菌体每一轮的回收率都在逐步提高，P/N值第四轮达到了93，表明四轮筛选的特异性都非常高.通过四轮筛选，特异性的噬菌体已经得到了有效的富集（见表1）.

表1 四轮亲和淘选中噬菌体的富集Tab.1 The enrichment of phages in four rounds of biopanning

2.2 aFGF特异性结合噬菌体的初步鉴定

根据Takayasu[12]等在2010年发表于BBB杂志上的文献作参考，将四轮筛选出的噬菌体做ELISA对照实验，结果见图1.

可以看出，每一轮筛选的特异性都在逐步提高，说明特异性噬菌体的富集效果很好.从少于～100个蓝斑的平皿上随机挑选24个分隔良好的单克隆做ELISA实验，可以得出2、7、8、20、21号的OD值与对照组相比有显著差异，其中8号噬菌体（P8）的特异性最显著.见图2.

2.3 aFGF结合肽的测序

将挑取的24个噬菌体单克隆扩增提DNA后，送华大基因公司测序，其中得出P8的展示短肽序列为AHVPSRS，与FGFR1中“—V220PSdkgnyt C229—”含有相同的基序.

图1 四轮筛选的噬菌体液ELISAFig.1 ELISA of phage mixture after fourth round

2.4 aFGF的竞争抑制实验

将P8噬菌体预先与aFGF充分结合，然后将混合物加到aFGF包被的96孔酶标板中.以两种不同作用形式的aFGF来竞争结合P8噬菌体，以此检测P8噬菌体与aFGF结合的特异性（见图3）.可以看出，随着游离aFGF浓度的逐步降低，对固相包被的aFGF与P8噬菌体结合的抑制作用亦随之降低，而野生型vcsM13噬菌体的抑制作用无明显变化.可以得出，筛选得到的P8噬菌体具有与aFGF高度结合的能力.

2.5 P8先导肽对aFGF诱导的Balb/c 3T3细胞增殖的影响

通过MTT实验，可看出p8噬菌体对aFGF诱导的Balb/c 3T3细胞增殖有明显的抑制作用（见图4）.随着噬菌体的浓度增高，细胞增殖的抑制效果也随之增高，抑制率高达73%，而野生型vcsM13噬菌体的影响作用却无明显变化.

图2 ELISA分析噬菌体阳性克隆与aFGF的结合能力Fig.2 The binding ability of the positive phage clones to aFGF analyzed by ELISA

图3 游离aFGF对P8噬菌体与固定化aFGF结合的竞争抑制作用Fig.3 Competitive inhibition of P8 phage binding to the immobilized aFGF by free aFGF

图4 P8噬菌体对aFGF诱导的Balb/c 3T3细胞增殖的影响Fig.4 Efects of P8 phage on Balb/c 3T3 cell proliferation induced by aFGF

3 讨论

噬菌体展示技术是一项筛选技术，将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的DNA则位于病毒粒子内.使大量多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，从而使各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过淘选得以快速鉴定[13].而噬菌体7肽库的特点是将外源7肽表达于pⅢ蛋白的N末端，而C端连接G-G-G-S多肽.以pⅢ融合子方式表达的多肽是低价的，而以pⅧ融合子方式表达的多肽则是高价的.这种高价pⅧ展示所增加的亲和力有利于筛选得到亲和力非常低的配体，而低价pⅢ展示则将筛选限制在具有较高亲和力的配体上.

用噬菌体肽库进行筛选时，筛选的严谨性和产量的关系很重要.筛选严谨性的提高，能提高噬菌体的特异性，但产量会因此而降低；如果产量太高，则会得到许多特异性低的噬菌体.因此，本实验通过改变不同的筛选条件来达到严谨性与产量的平衡：即减少每轮靶标蛋白包被量（15.0、10.0、5.0、2.5 μg）、减少每轮噬菌体与靶标蛋白的结合时间（2.0、1.5、1.0、0.5 h）、提高TBST中Tween-20的浓度（0.05%、0.10%、0.20%、0.40%），延长洗涤时间（1min/次、2min/次、3min/次、4min/次）.经过严谨性逐步提高的四轮筛选，高特异性的噬菌体得到了有效的富集.

aFGF的作用方式是先结合肝素，再通过HSPG与受体FGFR的胞外结合域相连，通过激活受体胞质部的酪氨酸自身磷酸化而引发信号通路发挥作用的，其中主要是与FGFR1相结合.本实验所使用的Balb/c 3T3细胞则从Balb/c小鼠的胚胎成纤维细胞获得，其细胞表面的受体FGFR1和FGFR2表达丰富.从实验数据可以看出，与野生型噬菌体vcsM13相比，P8噬菌体能够明显的抑制aFGF对Balb/c 3T3细胞的增殖作用.这可以说明，筛选得到的P8噬菌体与aFGF结合后，抑制了其与受体FGFR1的结合.P8噬菌体不是通过其他表面蛋白与aFGF结合的，而是竞争性结合了aFGF与FGFR1结合的位点，阻断了aFGF与受体FGFR1的结合，阻断了FGFR1的信号通路，从而有效地抑制了aFGF对Balb/c 3T3细胞的促分裂作用.本实验通过噬菌体展示技术，获得了与aFGF具有高度特异性结合能力的7肽.在此基础上，可对其具体的作用机制进一步研究，为下一步开发抗肿瘤新药打下基础.

[1]Itoh N,Ornitz D M.Evolution of the Fgf and Fgfrgene families[J].Trends Genet,2004,20：563-569.

[2]Payson R A,Canatan H,Chotari M A,et al.Cloning of two novel forms of human acidic fibroblast growth factor(aFGF)mRNA[J].Nucleic Acids Res,1993,21：489-495.

[3]张颐,高红,孙黎光.上皮性卵巢癌组织中AFGF及FGFR-1的表达及临床意义[J].中国医科大学学报,2004,33：75-77.

[4]张颐,尚海,孙黎光,等.AFGF和BFGF在卵巢癌的表达及细胞增殖的影响[J].癌症,2003,22：1162-1165.

[5]张颐,孙黎光,尚海,等.酸性成纤维生长因子在卵巢癌中的表达及其信号传导途径[J].中华医学杂志,2003,83：976-980.

[6]尚海,单吉贤,高红,等.大肠癌组织中aFGF bFGF及FGFR表达水平的研究[J].中国肿瘤临床,2003,30：424-427.

[7]Rosa S La,Sessa F,Colombo L,et al.Expression of acidic fibroblast growth factor(aFGF)and fibroblastgrowth factor reeceptor 4(FGFR4)in breat fibroadenomas[J].Journal of Clinical Pathology,2001,54：37-41.

[8]Tannheimer S L,Rehemtulla A,Ethier S P.Characetrization of fibroblast growth factor receptor 2overexpression in the human breast acncer cell line SUM-52PE[J].Breast Cancer Res,2000,2：311-320.

[9]SaeHeum S O,Wientjes M G,Gan Y,et al.Fibroblast Growth factors：An epigenetic mechanism of broadspectrum resistance to anticancer drugs[J].PNAS,2000,97：8658-8663.

[10]Smith GP.Filamentous fusion phage：novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface[J].Science,1985,228(4705)：1315-1317.

[11]Fan H,Liu Y,Zhou H,et a1.Selection ofpeptide ligands that bind to acid fibroblast growth factor[J].IUBMB Life,2000,49(6)：545-548.

[12]Takayasn Kawasaki,Kenji Onodera,Shunsuke Kamljo,et a1.Selection of Peptide Inhibitors of Soluble A 1-42 Oligomer Formation by Phage Display Biosci Biotechnology[J].Biochem,2010,74(11)：2214-2219.

[13]Parmley S F,Smith G P.Antibody.selectable filamentous fd phage vectors：Affinity purification of target genes[J].Gene,1988,73(2)：305-318.