微波辅助提取白花丹中黄酮的最佳工艺研究

朱伟伟

(河池学院 化学与生命科学系，广西 宜州 546300)

0 引言

白花丹为白花丹科植物白花丹(Plumbago zeylanica L.)的全草或根，始载于《唐本草》，入药首载于《生草药性备要》，别名:乌面马、白雪花、白皂药、山波苓、一见消、白花藤、火灵丹、假茉莉、猛老虎、白花岩陀等。生于气候温暖潮湿的地区，常见于向阳的小沟边，分布于云南、贵州、广西、广东、福建和台湾等省区，为东南亚许多国家及我国多民族医用药材［1－2］。白花丹在临床上主要用于治疗风湿关节疼痛、皮肤瘙痒、皮肤无名肿毒、跌打损伤、妇女产后流血不止及一些恶性疾病(如恶性肿瘤)［3］的治疗等，现代药理学研究表明:白花丹具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗肝损伤以及兴奋中枢神经系统等作用［4－5］，特别是抗肿瘤作用已引起高度重视，显示出很好的开发、利用价值。

目前从白花丹植物中分离得到的化学成分主要包括萘醌类、香豆素类、黄酮类、有机酸类、甾族类等成分［6］。张倩睿等［7］首次从白花丹中分离得到对羟基苯甲醛、香兰子酸、2，5—二甲基—7—羟基—色原酮、3—吲哚甲醛。但关于白花丹中总黄酮的提取研究报道较少。前期研究表明用微波法提取中草药中的总黄酮效果比较好［8］。本文以乙醇为提取剂，以白花丹总黄酮的提取量为指标，采用微波辅助法通过单因素试验和正交试验，旨在确定微波法萃取白花丹总黄酮的最佳工艺，为进一步研究白花丹的开发利用提供依据。

1 材料与仪器

白花丹(购于宜州市药材市场);芦丁标准品(上海源叶生物有限公司，纯度＞98%);无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、九水合硝酸铝(均为分析纯)。

Q－250A3高速多功能粉碎机(上海冰都电器有限公司);电热恒温水浴锅(北京市医疗设备厂);722N型可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);RE－52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);SHB－3型循环水多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);电热恒温水浴锅(北京市医疗设备厂);美的微波炉(AG832MF4－NR1)。

2 方法及结果

2.1 黄酮含量测定

2.1.1 样品的制备及处理

将白花丹放入电热鼓风干燥箱干燥，然后用粉碎机粉碎，过20目筛，放入干燥的烧杯中备用。准确称取1.00 g的白花丹粉末置于250 mL锥形瓶中，以乙醇为提取试剂，按不同比例加入不同浓度的乙醇溶液摇匀，将瓶口用保鲜膜封住，在不同微波功率下辐射加热一定时间，微波作用后于80℃下恒温水浴30 min，使黄酮尽量溶出，将浸提液进行减压抽滤，将滤液定容至50 mL，得到白花丹黄酮的提取液，备用。

2.1.2 标准曲线的绘制

准确称取芦丁对照品5 mg，用50%乙醇溶解，转移至50 mL量瓶中，制成0.1 g/L的芦丁对照品溶液。分别吸取上述溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于25 mL的比色管中，用体积分数50%乙醇稀释至10 mL，加入5%NaOH溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min;再加10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min，然后加1 mol/L NaOH溶液2 mL，再用50%乙醇定容25 mL，摇匀，静置15 min，不加标准溶液，只加显色剂同法制得空白对照液，在510 nm处测定其吸光度。得回归直线方程为:Y=0.011 4x－0.000 4(r=0.999 7)，结果表明芦丁在4～20 mg/L时，浓度与吸光度线性良好。

2.1.3 总黄酮的含量测定

精确吸取白花丹提取液1 mL于25 mL的比色管中，照标准曲线方法进行显色，在510 nm波长处测定吸收度，代入回归方程计算样品中总黄酮的质量浓度。

2.1.4 回收率试验

精密量取已知总黄酮含量的提取液6份，分别加入0.1 g/L芦丁对照品溶液0.5 mL，按2.1.2方法，测定吸光度，算出黄酮的平均提取率97.62%。结果见表1。

表1 白花丹总黄酮提取液芦丁加样回收率试验

2.1.5 精密度试验

精确吸取提取液1 mL置于25 mL比色管中，按2.1.2方法测定平均吸光度0.263 5，RSD 0.47%。

2.2 单因素考察

2.2.1 乙醇浓度对白花丹总黄酮提取率的影响

精确称取1.00 g白花丹粉末置于250 mL锥形瓶中，按固液比为1∶25依次加入40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，选取微波功率为300 W的条件下，微波辐射90 s，之后在80℃下恒温水浴30 min，按2.1.2方法测吸光度，计算总黄酮提取率分别为3.14%，3.38%，3.31%，3.25%，3.09%，乙醇体积分数为50%时总黄酮提取率最大(见图1)，故选择乙醇的体积分数为50%。

2.2.2 料液比对白花丹总黄酮提取率的影响

准确称取白花丹粉末 1.00 g，按料液比为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 依次加入体积分数为50%的乙醇溶液，选取微波功率为300 W，微波辐射时间为90 s，然后在80℃下恒温水浴30 min，按2.1.2方法测吸光度，计算总黄酮提取率分别为3.36%，3.54%，3.65%，3.53%，3.41%，固液比为1∶25时总黄酮提取率最大(见图2)，故选择1∶25。

图1 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

图2 料液比对总黄酮提取率的影响

2.2.3 微波辐射时间对白花丹总黄酮提取率的影响

精确称取白花丹粉末1.00 g，按固液比为1∶25分别加入体积分数为50%乙醇溶液，选取微波功率为300 W，分别作用30 s、60 s、90 s、120 s、150 s，在80 ℃下恒温水浴30 min 后，按2.1.2 方法测吸光度，计算总黄酮提取率分别为3.62%，3.68%，3.79%，3.62%，3.27%，微波辐射时间为90 s时总黄酮提取率最大(见图3)，故选择90 s作为微波辐射时间。

2.2.4 微波辐射功率对白花丹总黄酮提取率的影响

精确称取白花丹粉末1.00 g，按固液比为1∶25依次加入体积分数为50%的乙醇溶液，分别以微波辐射功率为100 W、200 W、300 W、400 W、500 W微波作用时间90 s的条件下，然后在80℃下恒温水浴30 min，按2.1.2方法测吸光度，计算总黄酮提取率分别为3.31%，3.68%，3.73%，3.45%，3.37%，微波辐射功率为300 W时总黄酮提取率最大(见图4)，故微波功率选取300 W。

图3 微波辐射时间对黄酮提取率的影响

图4 微波辐射功率对黄酮提取率的影响

2.3 正交实验结果

对各单因素的微波作用时间(A)、料液比(B)、乙醇浓度(C)、微波辐射功率(D)对黄酮提取工艺进行正交试验，并以总黄酮的提取率为判断指标，根据设置选用L9(34)正交表，试验方案设计及结果见表2、表3。

表2 白花丹总黄酮提取工艺正交试验因素水平

表3 白花丹总黄酮提取工艺正交试验安排

由表2、表3极差分析结果可以看出，影响白花丹总黄酮提取率的因素主次顺序为C＞A＞D＞B，即乙醇浓度＞微波辐射时间＞微波辐射功率＞料液比。确定最佳提取工艺组合为:A1B2C3D3，即微波辐射时间60 s、料液比1∶25、乙醇浓度60%、微波功率400 W。

2.4 验证试验

精确称取1.00 g白花丹粉末，在优化组合条件A1B2C3D3下，冷却，过滤，按2.1.2方法，测定吸光度，进行5次平行验证性试验，最佳工艺条件的验证结果是总黄酮平均得率为4.19%，RSD为0.8982%，说明该工艺稳定。

3 结论

用微波辅助法提取白花丹中总黄酮，微波照射时间不宜过长，以60～120 s为宜，超过此时间，会使提取率降低，这可能因为照射时间过长会导致温度过高而使得黄酮类物质分解;微波的功率在400 W左右比较适宜，过高也会造成黄酮类物质受热过高而分解，使萃取量下降;料液比在1∶25最为合适，当比值增大时萃取的黄酮量反而减少，可能是因过多的提取液吸收了大量的微波能，造成了药品吸收能量减少;乙醇体积分数是四个因素中影响最大的，其取值在50% ～60%最为合适，这可能和总黄酮中的结构有关。

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