荧光分光光度法测定大花红景天中红景天苷的含量

郑优娜，孙述文，唐林芳，于 婷，崔晓丽，高德阳，邱文慧，王孟亚 (吉林医药学院药学院:.200级药物制剂本科班，2.药学院化学教研室，.20级药物制剂本科班，吉林，吉林 20)

红景天是景天科多年生草木或灌木植物，生长在海拔800～2 500米高寒无污染地带的珍稀野生植物。由于其生长环境恶劣，如缺氧、低温干燥、狂风、受紫外线照射、昼夜温差大，因而具有很强的生命力和特殊的适应性。研究表明，红景天苷(Salidroside，图1)是高山红景天的主要药用活性成分［1］。它具有抗缺氧、抗疲劳、抗微波辐射等作用，还具有对神经系统、内分泌系统的调节作用和双向调节作用，具有延缓机体衰老、防止心血管疾病、抗肿瘤以及多种老年性疾病的作用［2-3］。因此，红景天苷在军事医学、航天医学、运动医学和保健医学等方面都具有十分重要的意义。

根据文献报道，测定红景天中红景天苷的含量的方法主要有:高效液相色谱法［4］、重氮化比色法［5］、薄层扫描法［6］、荧光分析法［7］等。由于HPLC仪器昂贵、所供组分复杂的试剂，需采用萃取，柱色谱等预处理方法对供试品进行纯化处理等局限性的存在会限制它的应用;而荧光分析法因仪器设备简单，易操作，灵敏度高，精确度高等优点受到广泛应用。查阅相关资料，仅有一篇报道荧光光谱法测红景天苷的文献，但无实际样品分析。本实验详细考察了红景天苷水溶液的荧光分析条件，并成功测定了西藏大花红景天中红景天苷的含量。

图1 红景天苷的分子结构式

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

仪器:RF-1501型荧光分光光度计(日本岛津公司);JY2001电子天平(上海精密科学仪器有限公司);800电动离心机(金坛市富华仪器有限公司);旋转蒸发仪:CH-9230 Flawil1(Buchi labortechnik AG);超声波清洗器:CU250(上海超声波仪器厂)。

试剂:红景天苷标准品(≥97.5%，HPLC，Aladdin，上海晶纯试剂有限公司);95%乙醇(天津市大茂化学试剂厂);无水硫酸钠(天津市北方天医化学试剂厂);饱和醋酸铅(沈阳市华东试剂厂);大花红景天(西藏，中国);实验用水全是蒸馏水。

1.2 红景天苷标准溶液

精密称取0.005 0 g红景天苷标准品，加少量蒸馏水溶解，定容到100 mL容量瓶中，浓度为50 mg/L，使用时用蒸馏水稀释定容。

1.3 实验方法

准确移取50 mg/L的红景天苷标准溶液0.5 mL，定容到50 mL容量瓶中，摇匀，再从中量取5 mL溶液定容到50 mL容量瓶中，浓度为0.05 mg/L。通过固定激发波长扫描发射光谱，固定发射波长扫描激发光谱的方法，分别找到最大激发波长和最大发射波长，并考察了放置时间和温度对红景天苷荧光强度的影响。

1.4 标准曲线的绘制

准确移取一定量50 mg/L红景天苷标准溶液，分别于7个50 mL容量瓶，用蒸馏水稀释定容至刻线，得到浓度为 0.00、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/L的标准溶液，在选定条件下，依次测定其荧光强度FI(n=3)，以荧光强度FI为纵坐标，红景天苷标准浓度c为横坐标，进行线性回归分析。

1.5 样品提取液的制备与测试

准确称取5.0 g西藏大花红景天，于250 mL锥形瓶加入95%乙醇100 mL，超声1 h，减压抽滤，旋转蒸发滤液，回收乙醇［8］，将残余液装入离心管中，加6 mL乙酸铅和2 mL饱和硫酸钠［9］，离心分离30 min(2 000 r/min)后取离心上清液，用0.45 μm滤膜进行过滤，将滤液定容到50 mL容量瓶中，使用时用蒸馏水稀释到线性范围以内测试。

2 结果与讨论

2.1 激发光谱和发射光谱

由于使用的是廉价的RF-1501型荧光分光光度计，虽有数据显示，但没有拷贝图谱的高级功能，所以设定狭缝宽度为10 nm，每间隔一段波长采集信号，通过描点的方法来绘制红景天苷的激发光谱和发射光谱。如图2所示，水溶液中红景天苷的最大激发波长为273 nm，最大发射波长为301 nm，与文献报道值一致［7］。

2.2 荧光强度随温度的变化

考察了浓度为0.05 mg/L的红景天苷标准品溶液在20～60℃之间荧光强度的变化，数据列于表1。从表1可以看出红景天苷标准品溶液随着温度的升高，荧光强度明显下降。在20℃时荧光强度最大，在60℃之间荧光强度最小，所以20℃是实验的适宜温度，因此本实验测量的温度条件选择在室温下进行。

图2 红景天苷的激发光谱和发射光谱

表1 荧光强度随温度的变化

2.3 荧光强度随放置时间的变化

考察了浓度为0.05 mg/L的新配置的红景天苷标准品在72 h内的荧光强度的变化，每间隔一定的时间测量并记录一次荧光强度，数据列于表2。从表2看出红景天苷的强度稳定，在72 h内变化不是很大。

表2 荧光强度随放置时间的变化

2.4 标准曲线

在选定条件下，依次测定 0.00、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/L 的红景天苷标准溶液，扣除空白溶液的影响，得到线性回归方程 FI=3 115.5c+221.73(r=0.999 0)，回归曲线如图3所示。检出限DL=0.005 mg/L(空白信号标准偏差的3倍对应的浓度)。

2.5 精密度实验

配制0.05 mg/L的红景天苷标准溶液，连续取样5次进行荧光强度的测试，其值分别为365.275、366.062、363.638、365.266、363.295，得到相对标准偏差RSD=0.32%(n=5)，表明该方法的精密度良好。

图3 红景天苷标准曲线图

2.6 样品定性检测

取1.5中的样品稀释约1万倍后，扫描其荧光光谱图发现，该溶液的荧光光谱与红景天苷标准溶液的光谱图几乎完全一致，定性的说明使用荧光分光光度法可以选择性的测定红景天提取液中的红景天苷的含量。

2.7 含量分析与计算

在选定的最佳条件下，对1.5中的样品提取液稀释1万倍后，进行了荧光强度的测试，数据列于表3。红景天苷的含量测试及提取率计算结果列于表4。计算公式:

表3 样品提取液的荧光强度

表4 样品中红景天苷含量分析

2010版《中国药典》中规定，红景天药材中红景天苷的含量应≥0.5%［10］，0.804%的含量高于该值，说明西藏大花红景天中的红景天苷含量颇丰。

3 结论

本研究考察了红景天苷在水溶液中的荧光光谱及发光特性，并对西藏大花红景天中的红景天苷进行了提取及定性、定量分析。结果表明，荧光分光光度法不仅具有仪器操作简单，灵敏度高等优点，而且适用于复杂试样的分析，尤其是分离比较困难的中药材中荧光物质的分析。值得关注的是，试样必须进行适当的稀释，否则容易发生荧光猝灭效应而导致荧光消失。红景天苷提取液的成功分析为我国中药材的质量评价提供了重要的分析依据。

［1］明海泉，夏光成，张瑞均.红景天研究进展［J］.中草药，1998，19(5):37-41.

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［3］王中风，吴永娴，曾凡坤.红景天资源的开发利用及前景［J］.中国林副特产，1997(3):48-49.

［4］杨晓艳，芦启琴，张晓峰.HPLC法测定红景天根皮中红景天苷的含量［J］.分析试验室，2008，27(z 1):305-306.

［5］张 群，傅尔康，齐发顺.重氮化比色法测定红景天苷含量［J］.中国医院药学杂志，1998，18(4):167-168.

［6］王运科，伟忠民，李 盈，等.薄层扫描法测定红景天保健食品(口服液)中红景天苷的含量［J］.锦州医学院学报，2006，17(4):44-46.

［7］韩 梅.HPLC-荧光检测法测定雪域红景天口服液中红景天苷的含量［J］.华西药学杂志，2005，20(5):441-442.

［8］程子毓，洪美花，陈元涛，等.恒温超声波法提取红景天根中红景天苷的工艺及含量测定研究［J］.青海师范大学学报:自然科学版，2008(3):80-82.

［9］包文芳，吴维春，李葆华.抗疲劳药用植物红景天［M］.北京:人民军医出版社，2004:134-136.

［10］中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典:一部［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:144.