水－氯涂膜剂中氯霉素体内外透皮释放评价

李海鹰，杨文智，王苗苗，田娇，申世刚

（1.河北大学化学与环境科学学院，河北保定 071002；2.河北大学药学院，河北保定 071002）

水杨酸是治疗痤疮的重要药物，现有上市治疗痤疮的含水杨酸非处方药，是皮肤科常用药［1］，氯霉素属广谱抗菌剂，可用于治疗各种感染，水杨酸与氯霉素制成的复方制剂临床用于治疗脂溢性毛囊炎、皮炎和痤疮［2－4］.涂膜剂是将药物溶解或混合在成膜材料的挥发性溶液中所制得的外用液体制剂，具有工艺简单、无需特殊设备、使用方便、容易清洗、不污染衣物的优点［5］.普鲁兰糖成膜性、阻气性、可塑性、粘性均较强，易溶于水、无毒、无色无味，广泛用于医药、食品和化工等领域［6］.普鲁兰糖符合涂膜剂基质的要求，但未见用作涂膜剂基质的报道.本文尝试制备水－氯普鲁兰糖涂膜剂（SACPP）［7］，考察涂膜剂中氯霉素体内外释放过程，为指导水－氯普鲁兰糖涂膜剂设计及应用提供必要的参考.

1 仪器与试药

FL2200高效液相色谱仪（浙江福立分析仪器有限公司）；Franz立式双室扩散池（中科院上海有机所）；B－629型超声波美容仪（15W，50～60Hz，吴邦美容美发设备有限公司）；SK－1快速混匀器（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；TGL－16离心机（上海安亭科学仪器厂）.

10Ku普鲁兰糖（上海普奥生物科技有限公司，食品级）；聚乙烯醇（PVA17－88）（天津市科密欧化学试剂有限公司）；水杨酸（天津市北辰骅跃化学试剂厂）；氯霉素（安徽省阜阳众诚药业有限公司）；丙三醇（天津市北方天医化学试剂厂）；氮酮（福建寿宁美菲思生物化学品厂）；其余试剂均为分析纯.

实验动物：18～22g雄性昆明种小鼠（合格证号：1003008）和1.5～2.0kg新西兰兔（合格证号：1005009）均由河北省实验动物中心提供.

水－氯普鲁兰糖涂膜剂［7］：称取普鲁兰糖0.75g和PVA17－880.375g，加去离子水40mL，浸泡加热使其溶解，加入12mL丙三醇混合均匀，得到空白涂膜液.称取3g水杨酸和3g氯霉素，用乙醇溶解，加入0.01g EDTA－2Na和1mL氮酮，混匀后加入到空白基质中，加热搅拌至完全溶解，趁热加入一定量乙醇，得到均匀的白色溶液，放置室温，以少量乙醇定容至100mL，即得白色水－氯普鲁兰糖涂膜剂.采用“2.1.2节”色谱条件测定氯霉素质量分数，批号为20100505，20100506，20100507的涂膜剂中氯霉素的质量分数分别为101.2%，99.8%和100.9%.

2 方法与结果

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 检测波长的确定

用乙醇配制适当质量浓度的氯霉素和空白基质溶液，过滤，取续滤液在200～500nm内，以乙醇为空白进行波长扫描.综合考虑氯霉素与水杨酸的最大吸收波长，最终确定氯霉素检测波长为300nm，空白基质无干扰.

色谱柱：Hypersil BDS C18（4.6mm×250mm，5μm），分析柱前接ODS C18保护柱；流动相：甲醇－水（V（甲醇）∶V（水）＝50∶50），磷酸调pH至3.0；流速：1.0mL／min；检测波长：300nm；进样量：20μL.

2.2 体外透皮释放实验

2.2.1 实验方法

采用立式双室扩散池作渗透实验装置，有效透过面积为2.69cm2，接收池体积为13.0mL.将离体鼠皮角质层朝向涂膜剂溶液，固定于立式双室扩散池，保证接受液与鼠皮另一侧充分接触.精密量取自制涂膜剂2mL，含氯霉素60mg，均匀涂敷鼠皮上，系统控温（32±0.5）℃，以磁力搅拌的生理盐水做接收液.分别于0.5，1，2，4，6，8，10，12，24h从接收池中精密移取1mL接收液，立即补充等量（32±0.5）℃生理盐水，测定接收液中不同时间点的氯霉素含量.按下式计算氯霉素的单位面积累积渗透量（Q），其中V为扩散池接收室的体积，ρn为第n次取样时接收液的质量浓度，ρi为第i次取样时接收液的质量浓度，Vi为取样量，A为有效透过面积.

2.2.2 标准曲线的建立

将氯霉素在丙酮中重结晶，干燥至恒重.精密称取氯霉素，用甲醇配成1.25mg／mL的氯霉素储备液.精密量取储备液配成不同质量浓度的标准溶液，按“2.1项”下方法进行分析，以峰面积A对质量浓度ρ（μg／mL）作图，得到氯霉素标准曲线为Y＝5.08×104ρ＋2.61×103，线性为0.25～20μg／mL（r＝0.999 5，n＝9）.涂膜剂基质和透皮释放液中成分对氯霉素测定均无影响，氯霉素保留时间为6.4min.

2.2.3 精密度和回收率实验

取一定浓度的氯霉素对照品溶液，每隔3h进行测定，连续测定5次.相同条件下连续测定5d，其日内和日间RSD值分别为1.4%和2.1%（n＝5）.在制备的涂膜剂中分别添加高、中、低3种质量浓度的氯霉素标准溶液，每种质量浓度各5份，处理后进行分析测定，计算回收率.氯霉素平均回收率为102.5%.以上结果表明：建立的色谱法可准确测定氯霉素体外透皮释放含量，方法可靠.

2.2.4 体外透皮实验结果

3.1 年龄与受教育程度 执行功能受年龄及教育程度的广泛影响，引起学者的极大关注。王静[26]采用威斯康星卡分类测验及TM评估重度抑郁显示执行功能损害与受教育年限有关。研究发现，首发抑郁症患者年龄越大、发病年龄越早，执行功能损害越明显；教育年限越长，工作记忆保持功能越好[27]。张玉欣等[28]发现抑郁症中年龄与执行功能呈负相关，受教育年限与其呈正相关。因此，提高教育程度是减少执行功能损害的有效途径。

依公式计算氯霉素的单位面积累积渗透量Q，将Q对时间t作图，结果见图1.氯霉素在6h内释放迅速，24h氯霉素累积透过百分率达到处方量的20%.

图1 水－氯普鲁兰糖涂膜剂中氯霉素累积释放曲线Fig.1 Chloramphenicol release profile of SACPP

以单位面积累积渗透量（Q）对时间（t）进行回归分析，采用零级、一级和Higuchi方程进行拟合，结果见表1.水－氯普鲁兰糖涂膜剂中氯霉素体外释放接近Higuchi方程，释放缓慢.处方中选择氮酮作为促渗剂，氮酮可改变脂质双分子层的致密性，增加脂质流动性，降低药物在角质层和毛囊根鞘扩散阻力，促进药物经表皮细胞和毛囊途径吸收［8］.乙醇可增强脂质流动性［9］；甘油常用于协同促渗，故水－氯普鲁兰糖涂膜剂处方中甘油、乙醇和氮酮联合促进氯霉素透皮吸收.实验中采用离体小鼠鼠皮相同部位，以减少个体差异对药物透皮的影响.

表1 水－氯普鲁兰糖涂膜剂中氯霉素累积渗透量与时间的拟合方程Tab.1 Correlation coefficients（r）for linear relationship over 24h release of model kinetics from fitting results for SACPP

2.3 兔体内药代动力学实验

2.3.1 动物涂膜剂实验

取健康新西兰兔，雌雄各半，按给药方式分为皮肤涂敷和超声后皮肤涂敷2组，每组6只.于实验前1周开始于实验室内饲养，实验前禁食12h，可自由饮水.给药前一天用脱毛膏去除兔背部两侧体毛，于正中至两侧划出8cm×8cm区供皮涂用.将自制涂膜剂均匀涂敷于家兔的背部划分区域，每侧10mL.分别在0.5，1，1.5，2，2.5，3，4，8，12和24h兔耳缘后静脉丛取血，置肝素钠抗凝离心管中.超声组兔脱毛后表皮用医用酒精湿润，超声探头紧贴在湿润兔表皮上进行间歇超声，每超声30s停2s，总共超声10min，立即涂敷涂膜剂.采用kinetica软件计算氯霉素在兔体内的药代动力学参数.

2.3.2 血样的处理

将抽取的血样置含肝素钠的试管中，离心处理后得到血浆.精密吸取血浆0.5mL，加入甲醇1.0mL，流动相0.3mL，涡旋混合器混匀，10 000r／min离心10min，吸取上清液0.6mL，置于50℃水浴中，用氮气吹干，残余物加0.1mL流动相溶解，10 000r／min离心10min，取上清液进行色谱分析.

2.3.3 标准曲线的建立

水－氯血样的色谱图如图2所示.药物峰形良好，分离完全，血浆内源性杂质对测定无干扰.用流动相配制不同质量浓度的氯霉素对照品溶液，在0.5mL空白血样中加入0.3mL不同质量浓度氯霉素对照品溶液和1.0mL甲醇，依2.3.2项下处理后，进行色谱分析.血样中氯霉素的标准曲线为：A＝3.21×104ρ＋1.80×10（r＝0.9884，n＝10），线性为0.025～1μg／mL.

图2 HPLC色谱Fig.2 HPLC spectrum

2.3.4 精密度和回收率实验

取一定质量浓度的氯霉素血样对照品溶液，每隔3h进行测定，连续测定5次.相同条件下连续测定5d，其日内RSD为6.3%（n＝5），日间RSD为7.9%（n＝5）.在家兔空白血浆中分别添加0.3，0.75，1.5μg／mL的氯霉素标准液，每种质量浓度各5份，处理后进行分析测定，计算回收率.高中低3种质量浓度的回收率分别为（81.2±4.6）%，（85.4±6.1）%和（88.7±4.7）%，平均相对回收率85.1%.以上结果均符合生物样品分析的要求.

2.3.5 兔药代动力学实验

表2为兔体内氯霉素药代动力学参数，药代动力学曲线见图3.兔表皮直接涂敷涂膜剂后，氯霉素1h达峰，质量浓度为1.24μg／mL.经超声处理后，氯霉素达峰质量浓度及时间未见明显变化.氯霉素血药质量浓度达峰后，逐渐下降，12h后血中氯霉素的浓度已经降至极低水平.超声处理后氯霉素透皮吸收能力增强，体内累积AUC比直接涂敷组大，超声处理有利于氯霉素的透皮吸收.文献报道氯霉素血药浓度达到25μg／mL可导致人体毒性反应［10］，故检测氯霉素制剂的体内血药质量浓度是评价其剂型安全性的必要工作.

表2 水－氯普鲁兰糖涂膜剂中氯霉素的兔体内药代动力学参数Tab.2 Pharmacokinetic parmameters after using SACPP to rabbits

图3 涂敷水－氯普鲁兰糖涂膜剂的兔体内氯霉素药－时曲线Fig.3 Mean plasma concentration－time curves（mean±SD）after using SACPP to rabbits.

2.4 体内外相关性

以不同时间点下兔体内氯霉素累积AUC（Y）对体外单位面积氯霉素累积渗透量（X）作图，得回归方程Y＝0.000 6X＋0.670 5，r＝0.982（n＝7），见表3.对相关系数进行显著性检查，计算统计量t＝r（n－2）1／2／（1－r2）1／2＝11.625，在显著水平α＝0.001，自由度为6的条件下，查得t0.001（6）＝5.208，因为t＞t0.001（6），表明水－氯普鲁兰糖涂膜剂体内外相关性显著，通过研究涂膜剂中氯霉素的体外释放可预测其体内药物吸收，实验数据可为水－氯普鲁兰糖涂膜剂临床应用提供参考.

表3 体内外实验不同时间下氯霉素的累积吸收Tab.3 Cumulative absorption of chloramphenicol at different time in vivo and in vitro

续表3Continue tab.3

3 结论

本文对自制的水－氯普鲁兰糖涂膜剂中氯霉素进行了体内外透皮释放研究，HPLC检测方法准确，可靠.通过对离体鼠皮的体外透皮释放实验，氯霉素的体外释放更符合Higuchi方程，可缓慢释药，24h累积释放处方量的20%.兔皮经间歇超声处理后涂敷涂膜剂，可一定程度增大氯霉素的透皮吸收.水－氯普鲁兰糖涂膜剂体内外释放具有相关性，体外释放可预测体内药物吸收，实验数据可为水－氯普鲁兰糖涂膜剂临床应用提供支持.

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