滋阴活血利咽颗粒质量标准研究

赵萱，傅超美，徐晓秋，游宇

滋阴活血利咽颗粒是由丹参、玄参、麦冬、黄连、牛蒡子、余甘子、桔梗、蝉蜕等中药组成的复方制剂，具有滋阴润燥、活血化瘀、解毒利咽的功效，用于治疗阴虚血瘀、邪毒滞留所致咽喉干燥、咽痛不适、咽内异物感的慢性咽炎[1]。为保证该药的用药质量，本试验采用高效液相色谱法测定制剂中丹参素钠的含量并进行了方法学验证，采用薄层色谱法对制剂中丹参、赤芍、黄连、牛蒡子及玄参进行了鉴别，所建立的方法简便、可靠、重复性好，可用于该制剂的质量控制。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；DiamonsilTM C18色谱柱（150×4.6 mm,5µm,美国迪马公司）；Sartorius-BS110S分析天平（德国赛多利斯公司）；AS10200A超声波清洗器（南京昕航科学仪器有限公司）；

丹参素钠对照品（批号：810-200004）、芍药苷对照品（批号0715-200211）、盐酸小檗碱对照品(批号:110713-200208）、丹参对照药材(批号： 0766-200417)、黄连对照药材 ( 批号: 120913-200407)、牛蒡子对照药材（批号： 0819 - 9802 )、玄参对照药材（批号：121008-200505），均购于四川省药品检验所，中国药品生物制品检验所提供。糊精、蛋白糖为药用规格。甲醇为色谱纯试剂，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 丹参的薄层鉴别 称取颗粒10 g，研细，加水50 mL，加盐酸调节pH值至1，用乙酸乙酯振摇提取两次，每次加入25 mL，合并提取液，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液；称取丹参对照药材2 g，加水200 mL，煎煮1.5小时，滤过，滤液浓缩至40mL，放冷，用乙酸乙酯振摇提取两次，每次加入25 mL，合并提取液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为对照药材溶液；取丹参素钠对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液；称取10 g阴性颗粒按供试品溶液的制备方法制备成阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述四种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，用甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(2:3:4:0.5:2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铁乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而阴性无干扰。见图1。

图1 .丹参的薄层鉴别

2.1.2 赤芍的薄层鉴别 称取颗粒10 g，加入饱和正丁醇20 mL振摇提取，正丁醇溶液加氨试液洗涤2次，每次加入10 mL，弃去氨试液，将正丁醇溶液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液；称取赤芍对照药材0.5 g，加乙醇10 mL，振摇5分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加2 mL乙醇使溶解，作为对照药材溶液；取芍药苷对照品，加乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液，做为对照品溶液；称取10 g阴性颗粒按供试品溶液的制备方法制备成阴性对照溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述四种溶液5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸-冰醋酸-水(15:0.5:1:1:2)为展开剂展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品、对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而阴性无干扰。见图2。

图2 赤芍的薄层鉴别

2.1.3 黄连的薄层鉴别 称取颗粒5 g，加甲醇25 mL，超声处理25 min，滤过，取滤液作为供试品溶液；黄连对照药材0.25 g，加甲醇25 mL，超声处理30 min，滤过，取滤液作为对照药材溶液；取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液；称取5 g阴性颗粒，按供试品溶液的制备方法制备成阴性对照溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述四种溶液5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，用苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水（4:2:1:1:0.2）展开[3]，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同的黄色荧光斑点，且阴性无干扰，见图3。

图3 黄连的薄层鉴别

2.1.4 牛蒡子的薄层鉴别 取本品颗粒10 g，加水20 mL溶解，加盐酸3 mL，置水浴中加热回流1小时，用三氯甲烷萃取两次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，水浴挥干，残渣加乙酸乙酯30 mL，活性炭1 g，加热煮沸，滤过，滤液浓缩至2 mL，作为供试品溶液；取牛蒡子对照药材粉末0.5 g，加水30 mL，煎煮1小时，冷却，滤过，加盐酸3 mL，置水浴中加热回流1小时，用三氯甲烷萃取两次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，水浴挥干，残渣加乙酸乙酯30 mL，活性炭1 g，加热煮沸，滤过，滤液浓缩至2 mL，作为对照药材溶液；称取10g阴性颗粒，按供试品溶液的制备方法制备成阴性对照溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述四种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，用环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(5:5:0.2)为展开剂展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铁乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同斑点，且阴性无干扰，见图4。

图4 牛蒡子的薄层鉴别

2.1.5 玄参的薄层鉴别 取本品颗粒10 g，加甲醇25 mL，浸泡1小时，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水25 mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加2 mL甲醇使溶解，作为供试品；取玄参对照药材粉末2 g，加甲醇25 mL，浸泡1小时，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水25 mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加2 mL甲醇使溶解，作为对照药材溶液；称取10 g阴性颗粒，按供试品溶液的制备方法制备成阴性对照溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述四种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，用三氯甲烷-甲醇(5:1)为展开剂展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同斑点，且阴性无干扰，见图5。

图5 玄参的薄层鉴别

2.2 丹参素钠的含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：DiamonsilTM C18色谱柱（150×4.6 mm，5 µm）；柱温：30 ℃；流速：1 mL﹒min-1；灵敏度：0.05 AUFS；检测波长：281 nm。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取丹参素钠对照品适量，加甲醇制成每1 mL含丹参素钠 0.1161 mg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取适量颗粒，研细，置100 mL具塞锥形瓶中，加入60%甲醇50 mL，超声提取40分钟，放冷，称定重量，以60%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性溶液的制备 精密称取缺丹参的阴性颗粒按供试品溶液制备方法制备，即得。

2.2.5 线性范围的考察 精密吸取浓度为0.1161 mg﹒mL-1的丹参素钠对照品2，4，6，8，10，15，20 µL，依次进样。测定峰面积值，并以峰面积值（A）对进样量C（µg）线性回归，得回归方程为：A = 529980C + 4789.6 （r=0.9997）。试验结果表明，丹参素钠在0.2322 ~2.322 µg范围内峰面积值与进样量有良好线性关系。

2.2.6 专属性考察 精密吸取丹参素钠对照品溶液、供试品溶液、阴性溶液各10 µL，依次进样，测定得丹参素钠对照品、供试品均出现丹参素钠特征峰，而阴性溶液无该特征峰。供试品中丹参素钠与其它组分可达基线分离，保留时间适当，与邻近色谱峰的分离度R>1.5，按丹参素钠峰计算理论塔板数n>3000。结果表明，在选定条件下处方中其他成分对丹参素钠的含量测定无干扰。所得图谱见图6、图7、图8。

图6 丹参素钠对照品溶液的HPLC图谱

图7 供试品溶液的HPLC图谱

图8 阴性溶液的HPLC图谱

2.2.7 精密度考察 精密吸取丹参素钠对照品溶液10µL，连续进样6次，测定峰面积值并计算丹参素钠的含量，计算丹参素钠峰面积的RSD为0.26%，结果表明仪器精密度良好。

2.2.8 重复性考察 按照“2.2.2”项下供试品溶液制备方法，取同一药液6份制备供试品溶液，分别进样10 µL，测定峰面积值并计算丹参素钠的含量。丹参素钠的含量的RSD为1.47%，结果表明方法重现性良好。

2.2.9 稳定性实验考察 精密吸取同一供试品溶液和丹参素钠对照品溶液，于0，2，4，6，8，10，12，24 h分别进样10 µL，并测定不同时间点的峰面积。结果表明，对照品溶液峰面积的RSD为1.20%，供试品溶液峰面积的RSD值为1.16%。供试溶液和对照品溶液在24小时内较为稳定，可满足测定需要。

2.2.10 加样回收率实验考察 精密吸取已知含量的供试品溶液（丹参素钠含量为1.54 mg﹒g-1)适量，共计9份，置25 mL容量瓶中，分别加入丹参素钠对照品溶液（0.1132mg﹒mL-1）1，1，1，2，2，2，3，3，3 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品试液，测定峰面积并计算回收率，试验结果见表1。

表1 加样回收率测定结果

结果表明，加样回收率在95%～105%之间，平均回收率为97.08%，符合含量测定的要求。

2.2.11 样品的含量测定 取三批样品，按“2.2.2”项下方法制得供试品溶液。精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10 µL，注入液相色谱仪，记录峰面积值，计算丹参素钠的含量，结果见表2。由以上测定结果可知，3批样品含量的均值为

表2 样品中丹参素钠含量测定结果

1.535 mg﹒g-1，考虑到药材的来源、炮制加工、制剂生产及贮存等因素，含量限度在三批均值的基础上下降20%，故暂定本品每克含丹参素钠不得少于

1.228 mg。

3 讨论

3.1 滋阴活血利咽颗粒源自于长期运用于临床治疗慢性咽炎的经验方——滋阴活血利咽汤，该方以汤剂形式运用于临床多年，疗效显著。研制滋阴活血利咽颗粒，既体现了传统汤剂疗效好、见效快的特色，又有服用剂量小、贮存、携带方便等优点。慢性咽炎的患者多伴有咽部发干、异物感或轻度疼痛等症状，本品较之于片剂、胶囊剂等其他固体剂型，更利于患者服用。

3.2 在鉴别中，分别以丹参素钠对照品、丹参对照药材、芍药苷对照品、赤芍对照药材、盐酸小檗碱对照品、黄连对照药材、牛蒡子对照药材、玄参对照药材为对照，对方中丹参、赤芍、黄连、牛蒡子、玄参进行了薄层色谱鉴别。在对黄连进行薄层鉴别中，预实验中出现拖尾现象，后经分析，或因黄连有效成分为生物碱，因此在展开时适当熏以氨蒸气以克服拖尾现象；在对牛蒡子进行薄层鉴别中，预实验中先采用常规方法以乙醇为提取溶剂制备牛蒡子对照药材溶液，而所得薄层色谱上斑点偏多，主斑点Rf值偏高，难以与样品对应，多次试验之后，将牛蒡子药材加盐酸溶解，而后喷以5%三氯化铁乙醇溶液显色，鉴别其酚性成分，色谱图上显一个主斑点，特征性强。

3.3 含量测定中，丹参素钠是处方中君药丹参的主要水溶性有效成分，其含量的高低对制剂临床疗效影响较大，因此，选择丹参素钠含量作为含量测定指标。

[1] 彭顺林,钟渠.滋阴活血利咽汤治疗慢性咽炎47例疗效观察[J].甘肃中医,1998,11(6):14.

[2] 国家药典委员会.中国药典[S].北京:中国医药科技出版社,2010:70.

[3] 韦松基,王志萍,曹宇,等.壮药依肝达颗粒质量标准研究[J].时珍国医国药,2011, 22(11):2674.