2株B型副鸡禽杆菌的分离鉴定

杨国良，郑 杰，张 洪，龙进学，张发明，张 坦，孙丰廷，邓秋红，张 红，王文泉

(北京华都诗华生物制品有限公司，北京 102600)

鸡传染性鼻炎(Infectious Coryza，IC)是由副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum，Apg)引起鸡的一种急性呼吸道疾病，该病可使育成鸡生长发育不良和产蛋鸡产蛋明显下降(可引起产蛋率下降10% ～40%)［1］。在我国主要发生在北京、西安等一些北方的养殖场，在南方很少有报道［2］。其主要特征是发病率高而死亡率低，但饲养环境恶劣、寄生虫、营养不良或伴发其他疾病，如禽痘、传染性支气管炎、传染性喉气管炎等，可使传染性鼻炎的病情加重，持续时间会更长，引起死亡率增加［3－4］。由于康复的带菌鸡是主要的传染源，所以不提倡从不明来源的地方购买种公鸡和开产鸡的习惯做法，除非知道鸡群来源于无传染性鼻炎鸡场，否则只应购买1日龄鸡作为后备鸡。预防和控制本病的理想措施是远离老鸡群进行隔离饲养。要从鸡场中彻底消除病原，必须首先清除感染鸡或康复鸡，对禽舍和设备进行清洗和消毒后，在重新饲养清洁鸡之前，禽舍应空闲2～3周。

按照Page平板凝集试验的分型方法，副鸡禽杆菌可分为A、B和C三个血清型。各型之间不产生交叉保护［5］，一种血清型制备的菌苗免疫鸡，只能对同源菌的攻击提供保护。2003年张培君等在辽宁首次分离到了B型副鸡禽杆菌［6］，结合本次北京所分离到的2株B型副鸡禽杆菌，说明我国B型Apg的存在已经不局限于某地的暴发，而是有蔓延的趋势。这就要求现阶段养殖户在免疫时有必要将传染性鼻炎疫苗与目标鸡群中存在的血清型相匹配，这样才能达到最理想的免疫效果，从而防止蔓延。基于此，我国应该积极研制B型副鸡禽杆菌的单苗或联苗，以打破国内以A型、C型单双价灭活疫苗为主的格局。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 标准菌株 C－Apg－8(Page A型)由中国兽医药品监察所提供。

1．1．2 鼻炎疫苗 鸡传染性鼻炎(A型)灭活疫苗由北京华都诗华生物制品有限公司提供。

1．1．3 培养基 鸡肉汤培养基、鸡肉汤琼脂、半合成培养基参照冯文达等的方法制备［7］。

1．1．4 主要试剂及试剂盒 DNA Marker、DNA聚合酶、dNTPs，TaKaRa公司;其他试剂均为国产分析纯，均由国药集团化学试剂有限公司提供。

1．1．5 病料信息 病鸡来源于北京平谷和延庆某公司鸡场，具有鸡传染性鼻炎的临床症状。主要表现为脸部肿胀，鼻孔有粘性分泌物流出，有时打喷嚏，食欲及饮水减少，体重减轻，精神沉郁，缩头，呆立。6 d内蔓延全群，85%的鸡出现症状。

1．2 方法

1．2．1 菌株分离 将具有典型临床症状的病鸡处死，鸡头表面消毒，无菌切开眶下窦，用接种环蘸取眶下窦内容物，在含有NAD(辅酶Ⅰ、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的鸡血清琼脂平板上划线，同时接种普通肉汤和普通琼脂平板作为对照，然后将平皿倒置于37℃ 5%CO2培养箱内培养16～20 h，挑取单个可疑菌落进行纯培养，同时将纯培养产物作为研究对象，进行下一步鉴定。

1．2．2 无杂菌检验 将北京平谷、延庆所分离的可疑菌落纯培养物接种葡萄糖蛋白胨(GP)、酪胨琼脂(GA)斜面、硫乙醇酸盐(TG)小管各2支，每支0．2 mL，其中1支置37℃培养，1支置25℃培养，观察3～5 d。

1．2．3 过氧化氢酶试验 挑取典型的菌落进行过氧化氢酶试验，如有气泡即为阳性反应。

1．2．4 种子液活菌计数方法 采用微量点板计数法。选择适宜的四个稀释度，每个稀释度接种2点，接种量为10μL，接种含有NAD的鸡血清琼脂平板使其自然扩散。于CO2培养箱培养18～24 h(37℃、5%CO2)。依照 GB4789．2－94中的方法开展活菌计数。

1．2．5 PCR鉴定方法 按常规方法处理细菌培养物，将上述培养物取2μL作为模板，进行 PCR。PCR程序参照陈小玲等的方法进行:98℃变性2．5 min。反应过程为94℃ 1 min，65℃ 1 min和72℃2 min，循环25次，然后94℃ 1 min，65℃ 1 min，72℃ 10 min循环1次。PCR产物经0．8%琼脂糖凝胶电泳分析［8］。

1．2．6 引物合成 根据陈小玲等发表文章中已知的引物序列［9］，由Invitrogen北京分公司合成。上游引物P1:5’－TGAGGGTAGTCTTGCACGCGAAT－3’;下游引物 P2:5’－ CAAGGTATCGATCGTCTCTCTACT －3’。

1．2．7 回归试验 取培养至对数生长期的新鲜菌液，经过活菌计数并且将其稀释至规程要求的范围，眶下窦接种70日龄的SPF鸡，其中试验组和对照组分3个隔离器饲养，接种后逐日观察其临床表现。试验情况见表1。

表1 攻毒情况记录表

1．2．8 免疫攻毒试验 取60～90日龄SPF鸡28只，其中免疫组、对照组在分别接种A型鼻炎疫苗、PBS 30 d后各眶下窦内注射平谷株、延庆株以及A型细菌培养物，分5个隔离器饲养，观察14 d，试验情况见表2。

表2 免疫攻毒情况记录表

1．2．9 水平传播试验 取60～90日龄SPF鸡40只，其中6只一组(3只作为攻毒组，3只作为PBS对照组)，14只一组(3只作为攻毒组，11只作为PBS对照组)，分别放入饲养面积相同的1～4号隔离器中饲养。每组鸡按要求各眶下窦内接种平谷株、延庆株细菌培养物，接种后逐日观察其临床表现，试验情况见表3。

表3 Apg水平传播试验记录表

1．2．10 分离菌株血清型鉴定 将菌株用20%甘油保存，送匈牙利诗华研发中心代为鉴定。

1．2．11 序列测定与分析 从琼脂糖中回收PCR产物目的片段，用双脱氧法直接对PCR产物进行测序，为了保证序列准确性，同时反向测定序列加以验证。并将所测定的2株B型副鸡禽杆菌基因序列与NCBI基因库中参考株(GenBank登录号:DQ132874．1)相应序列进行比较分析。

2 结果

2．1 细菌分离及初步鉴定 从平谷、延庆可疑病鸡眶下窦内各分离到1株细菌，此菌在含有NAD的鸡血清琼脂平板上形成边缘整齐、半透明露滴状的小菌落，在普通肉汤和普通琼脂平皿上不生长。挑取可疑菌落进行革兰氏染色，镜下可见两级浓染的革兰氏阴性短杆菌。过氧化氢酶试验结果均为阴性，无杂菌检验显示葡萄糖蛋白胨(GP)、酪胨琼脂(GA)斜面上均无菌生长，硫乙醇酸盐(TG)小管有轻微细菌生长。

2．2 PCR反应结果 如图1所示，平谷、延庆菌株与标准阳性对照菌株、阴性对照一起，经PCR仪按照设定程序扩增后，经0．8%琼脂糖凝胶电泳25 min，结果显示分离菌株与标准阳性对照菌株均在0．5 kb位置出现了大小相同的DNA条带，与预期的扩增片段大小一致。

图1 分离菌株的PCR鉴定结果

2．3 回归试验 用平谷、延庆分离菌株人工感染SPF鸡24 h后均出现食欲减退、眶下窦及脸部严重肿胀、呆立、鼻孔有粘液流出等典型的IC临床发病症状。在感染鸡的眶下窦内又重新分离到了副鸡禽杆菌菌落。剖检病变主要为两侧眶下窦内有粘液样物质分泌，眼结膜充血。接种PBS的对照鸡，至观察结束未出现IC发病症状。

2．4 免疫攻毒试验 副鸡禽杆菌平谷株对照组4/4发病，免疫组1/8保护为不合格;延庆株对照组4/4发病，免疫组0/8保护为不合格(根据《中华人民共和国兽药典》:对照组4/4发病，免疫组6/8保护为合格。对照组3/4发病，免疫组7/8保护为合格)。而接种A型疫苗+A型菌液的对照组100%保护(4/4)。

2．5 水平传播试验 1、3号隔离器中的攻毒组3/3发病，对照组至观察结束未见IC发病症状。2、4号隔离器中的攻毒组3/3发病，对照组在攻毒后第5天相继出现了食欲减退、脸部肿胀、流鼻涕、打喷嚏等IC发病迹象。随后对2、4号隔离器中对照组鸡进行细菌的分离培养及PCR检测鉴定，证明所分离到的菌株为副鸡禽杆菌。

2．6 血清型鉴定结果 将所分离到的平谷株、延庆株Apg经匈牙利诗华研发中心代为鉴定，其结果为B型副鸡禽杆菌。

2．7 序列测定与分析结果 经序列测定，克隆的PCR产物长度为500 bp，与预期的扩增片段长度相符。应用DNASTAR软件进行基因核苷酸序列遗传距离分析，结果显示平谷株、延庆株基因序列同源性达到99．6%，而与 NCBI基因库中参考株(GenBank登录号:DQ132874．1)Modesto的基因序列同源性达到98．3%、98．8%，结果见图2。

图2 B型副鸡禽杆菌基因核苷酸序列遗传距离分析结果

3 讨论

3．1 本试验中分离菌在含NAD的鸡血清琼脂平皿上呈露滴状生长，在普通肉汤和普通琼脂平皿上不生长;革兰氏染色为阴性短杆菌，两极浓染;过氧化氢酶试验结果为阴性;无杂菌检验显示在GA、GP上均无菌生长，但在TG小管中有轻微细菌生长;将分离菌人工感染SPF鸡24 h后均出现眶下窦及脸部严重肿胀、食欲减退、呆立、鼻孔有粘液流出等典型的IC临床发病症状，同时在感染鸡的眶下窦内又重新分离到了副鸡禽杆菌;在PCR结果阳性的基础上，用已知Apg A型鼻炎灭活疫苗免疫SPF鸡后接种平谷、延庆分离菌株，均不能保护，而接种A型菌株的对照组100%保护(4/4)证明所分离到的Apg肯定不是A型。为了进一步验证分离物，将分离到的Apg送匈牙利诗华研发中心代为鉴定。鉴定结果与攻毒保护试验结果一致，可以判定该分离物为B型副鸡禽杆菌，暂命名为副鸡禽杆菌平谷株和延庆株。

3．2 鸡传染性鼻炎传播途径主要以飞沫及尘埃经呼吸传播，本次传播试验中，使用相同面积饲养的1、3号隔离器内的6只鸡没有发生水平传播现象，而2、4号隔离器内的14只鸡在攻毒后第5天相继出现了精神沉郁、食欲减退、鼻孔有粘性分泌物流出、脸部肿胀、打喷嚏、缩头、呆立等IC发病迹象。由此可见，本病的发生和反复发作与饲养密度有很大的关系。

3．3 由免疫攻毒试验得知，传染性鼻炎A型灭活疫苗免疫过的SPF鸡对平谷、延庆分离菌株的攻击没有起到保护作用，此结果与该菌株的血清型的鉴定结论一致。由于灭活的鸡传染性鼻炎疫苗只提供针对疫苗中含有的Page血清型的保护，因此菌苗中关键要含有目标鸡群中存在的血清型。Page B型已经证实是一种真正存在的具有完全致病性的血清型，并且发生很广，这就是说，在存在血清型B的地区使用的灭活菌苗中必须含有这一血清型。然而，由于血清型B的不同菌株间只能提供部分交叉保护［10］，因此在血清型B流行的地区有必要加快鸡传染性鼻炎多价疫苗的研究。

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