巨细胞病毒对小鼠心脏移植术后急性排斥反应的影响

彭润生，陈 昊，杨兆华，王春生

（复旦大学附属中山医院 心外科，上海市心血管病研究所，复旦大学器官移植中心，上海200032）

目前，同种异体心脏移植已经成为治疗终末期心脏病的有效手段，但感染与排斥反应仍然是影响治疗效果的重要因素［1］。在人体器官移植中，巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）是一种最常见的机会性感染病原体，其引起的感染不仅可以直接导致受体患者死亡，而且可以加速移植器官的急、慢性排斥反应，导致移植器官的功能减退甚至丧失，影响治疗效果［2］。本研究利用小鼠腹腔异位心脏移植模型研究巨细胞病毒感染对同种异体心脏移植急性排斥反应的影响。

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．1．1 实验动物 受体BALB／c小鼠，雌性，体重20－25g，10－12w，供体C57BL／6小鼠体重20－25g，8－10w，购自复旦大学实验动物科学部。

1．1．2 小鼠巨细胞病毒 小鼠巨细胞病毒Smith株（MCMV Smith）由复旦大学病毒研究所惠赠，在健康纯系BALB／c小鼠唾液腺中传代扩增。鼠胚成纤维细胞（murine embryofibroblast，MEF）购于中国科学院上海分院。

1．2 实验方法

1．2．1 MCMV Smith株小鼠体内传毒 采用健康纯系BALB／c小鼠，环胞素 A（CsA）（20mg／kg）腹腔注射，每日1次，直到2w后处死。第1次CsA注射后第2天，小鼠腹腔接种MCMV Smith病毒悬液104PFU。2w后处死小鼠，取唾液腺，用无血清Dubecco DEMEagle培养液充分匀浆后，离心，3 000r／min，20min，取上清分装，－80℃冰箱保存。

1．2．2 MCMV Smith株感染性测定（蚀斑形成实验） DMEM培养液加3%新生小牛血清（BAS，浙江三利公司），将病毒稀释为10－1～10－12PFU；取100μl接种于24孔无菌培养板内已生长成单层的MEF细胞上，做3个复孔。用含1%琼脂糖的维持液覆盖，置5%CO2培养箱，37℃培养4－5d取出，以10%甲醛固定30min，冲洗，除去每孔中的琼脂凝块。用0．5%结晶紫染色5min，置显微镜下观察计数各孔空斑数，计算所制备的MCMV Smith株的感染性病毒量。PFU／ml＝蚀斑均数×病毒稀释倍数／病毒接种量（ml）。

1．2．3 小鼠腹腔异位心脏移植模型建立 采用Ono术式进行小鼠腹腔异位心脏移植，即供体小鼠升主动脉与受体小鼠腹主动脉端侧吻合，供体小鼠肺动脉与受体小鼠腹部下腔静脉端侧吻合。术后每日经腹壁触摸移植心跳情况，若无心跳，则表明移植心脏死亡。移植后72h移植心脏停跳或受体死亡，视为手术失败。

1．2．4 实验动物分组 实验动物分为3组，每组20只。同质移植组（A组）：供受体皆为BALB／c1．2．小鼠。当日起，每日腹腔注射与CsA等量的生理盐水，并于术后第2d腹腔注射与MCMV等量的生理盐水0．2ml，术后10d处死。CsA 组（B组）：BALB／c小鼠为受体，C57BL／6小鼠为供体，术后当日即给予CsA注射液20mg／kg，每日1次，术后第2日腹腔注射生理盐水0．2ml；CsA＋MCMV干预组（C组）：BALB／c小鼠为受体，C57BL／6小鼠为供体，术后当日即腹腔注射CsA注射液20mg／kg，每日1次，术后第2日腹腔接种104PFU MCMV0．2 ml。

术后观察指标及标本收集 术后观察心跳情况，心脏跳动停止为实验终点。术后第10d，各组处死10只，将移植心脏取出，分别做病理组织学和病毒滴度检测。

1．2．5 病理组织学检查 移植心脏在10%中性福尔马林固定24h，脱水，常规石蜡包埋、切片，进行HE染色。

1．2．6 MCMV病毒滴度测定 采用蚀斑形成实验测定移植心肌中和自身心肌MCMV病毒滴度。

1．3 统计学分析 测量数据以均值±标准差（mean±S）表示，采用SPSS12．0统计软件进行处理。组间均数比较采用单因素方差分析（one way ANOVA variance analysis），P＜0．05被认为差异有显著性。

2 结果

2．1 移植心存活时间 术后C组于第5、7日各死亡1只，其余各组均存活。到第10日，移植心脏均存活。但C组移植心脏跳动明显减弱，且心律快慢不齐，A组移植心脏跳动有力，规则，而B组移植心脏跳动介于A组和C组之间，节律尚规则。移植心脏平均存活时间，A组长期存活，B组为16．7±1．9 d，C组为12．4±1．3d。C组移植心的存活时间较B组显著缩短（P＜0．01）（表1）。

表1 各组移植心脏存活时间（d）

2．2 病理组织学改变 术后10d，A组移植心脏大小基本正常，无水肿，色红质软，搏动好，与周围组织无粘连；心肌间质偶见水肿和炎细胞浸润，心肌细胞结构基本完整，几无排斥反应；B组移植心脏搏动有力，颜色鲜红，质软，与周围粘连较轻，心脏增大不明显；镜下观察移植心脏心肌间质内有局灶性炎症细胞浸润，心肌有变性；C组移植心脏搏动微弱，体积明显增大，重量增加，肿胀明显，与周围组织粘连，质地变硬，弹性减弱，颜色灰暗，局部呈苍白色。镜下见心内、外膜下及心肌间质有弥漫性淋巴细胞及单核细胞浸润；心肌细胞可发生变性、坏死。（见 图1）。

图1 各组移植心脏病理组织学改变

2．3 C组移植心肌和自身心肌MCMV病毒滴度测定结果 采用蚀斑形成实验测定移植心肌中和自身心肌MCMV病毒滴度（见表2、3），术后10d移植心肌的病毒滴度远大于自身心肌的病毒滴度（P＜0．01），观察终点即移植心脏停止跳动时移植心肌的病毒滴度远大于自身心肌的病毒滴度（P＜0．01）。

表2 术后10日移植心肌和自身心肌的病毒滴度

表3 观察终点移植心肌和自身心肌的病毒滴度

3 讨论

CMV是一种常见的疱疹病毒，分布广泛，我国是HCMV感染的高发地区，儿童血清抗HCMV阳性率 为 83．2% －87．3%，成 人 则 达 95% 以 上［3］。CMV是一种比较常见的条件性感染的病原体，在免疫力正常的个体，其通常表现为隐性感染，但对于器官移植及免疫妥协（如应用免疫抑制剂、AIDS等）个体来说，常导致CMV感染或隐性感染复发，并且参与移植器官的急、慢性排斥反应，造成移植器官失功甚至受体死亡。

由于CMV具有严格的种属特异性，难以建立HCMV感染动物的模型，鼠巨细胞病毒（MCMV）和HCMV相似，具有很大同源性，所以研究 MCMV对移植后的感染和急、慢性排斥反应及其相互关系来探讨HCMV关于这方面的机制，对于临床具有指导意义。

愈来愈多的临床资料及动物试验表明，CMV参与器官移植的急性排斥反应［1，4］。本实验也进一步验证MCMV感染加重小鼠移植心脏的急性排斥反应，MCMV感染组小鼠移植心脏存活时间明显少于非MCMV感染组，病理学改变亦支持MCMV感染加重小鼠移植心脏的急性排斥反应，非MCMV感染组病理组织学表现，心肌损害明显低于MCMV感染鼠。

心脏移植术后，为防止移植物排斥，需要免疫抑制药物抑制Th1类免疫反应，最理想的免疫状态是调节Th1／Th2类反应处于一个新的平衡，使Th1类反应即不至于过强而发生排斥反应，也不至于过弱而招致感染，尤其是机会性病原体感染。CMV感染多发生于心脏移植术后1年，尤其1－3月［5］，此时Th1／Th2类反应没有建立一个新的平衡，免疫系统紊乱，免疫抑制药物也处于不断调整之中，一旦过量，极易导致CMV感染，感染之后，机体为了控制、杀灭CMV，重新调整两类反应的平衡。CMV是细胞内感染的病原体，其清除有赖于细胞免疫，上调Th1类应答，通过上调IL－2、TNF及IFN－γ等细胞因子［6］，增强 CTL、单核细胞、单核巨噬细胞、NK细胞的活性，这不仅仅控制、杀灭CMV，同时也是介导同种异体器官移植排斥反应的主要效应细胞，引起急性排斥反应［7］。关于CMV感染与急性排斥反应，以往的观点也认为是机体与CMV相互作用，Th1应答上调，细胞因子分泌增加或功能增强介导急性排斥反应［8］，也有研究认为 CMV IE1 和IE2基因产物协同作用反式激活了细胞间黏附分子（ICAM－1）基因启动子区域，从而促进ICAM－1 mRNA表达上调［9］。这种作用是CMV IE基因直接作用的结果，并不是宿主细胞产生的细胞因子，如TNF－α、IL－1、IL－6、转化生长因子－β（transforming growth factor－β，TGF－β）等介导的。

研究中发现，MCMV干预组的移植心肌的病毒滴度（蚀斑形成实验）远远高于自体心肌中的病毒滴度（P＜0．05）。其具体机制尚不清楚。如前文所诉，T淋巴细胞介导的细胞免疫在清除CMV中起关键作用，但是，CTL（CD8＋淋巴细胞的一种表型）通过“HLA限制性”识别方式识别高表达HLA－Ⅰ类抗原的受感染细胞而对CMV起到杀灭作用［9］，就是说，CTL只能识别CMV感染的自身细胞，通过HLA－Ⅰ类抗原的桥联作用而杀灭CMV，对于HLA－Ⅰ类抗原不同的移植心肌细胞而言，当感染CMV时，CTL就显得无能为力，这可能就是 MCMV干预组的移植心肌的病毒滴度（蚀斑形成实验）远远高于自体心肌中的病毒滴度的原因。另外，机体还有一种免疫细胞，NK细胞，NK细胞通“丢失自我（self－missing）”的识别方式，识别 HLA抗原表达低下或不表达的靶细胞以及HLA抗原突变的靶细胞，在抗病毒中起极其重要的作用［10］。研究表明，NK细胞不仅直接对CMV有杀伤作用，而且，还能增加CD8＋T细胞攻击CMV的功能，由此可见，NK细胞可能是清除移植器官中CMV的关键［11］。

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