硫磺与水杨酸配施对韭菜硝酸盐累积及氮代谢的影响

李晓峰，王俊玲，李林妍，谢 鑫，高志奎*

(1河北农业大学园艺学院，河北保定071001;2河北农业大学生命学院，河北保定071001)

叶类蔬菜喜硝态氮，极易引起硝酸盐积累，不仅影响蔬菜的营养品质［1］，还严重影响到人类的健康［2］。基于“吸收大于还原”是导致硝酸盐累积的观点［3］，以往的大量研究普遍采用减控氮素供给的配方施肥等措施来降低硝酸盐累积并取得了显著成效［4－6］，本实验室的研究从促进NO－3还原调控的角度入手，探索出积极有效地降低NO－3累积的措施［7－9］，水杨酸(salicylic acid，SA)效果尤为突出，可在降低NO－3含量的同时将液泡中累积的无效氮转化合成氨基酸、蛋白质等被植物体所利用。

现代植物生理生化研究表明，氮和硫两元素在生理代谢，特别是蛋白质合成方面表现出高度的协同关系［10］。硫的缺乏可使硝酸盐的吸收和从根系到叶片的运输受到明显的抑制，并且，随着硫元素的持续匮乏，蛋白合成也将受到明显的抑制［11］。Hawkesfordt等［12］认为不充足的硫供应导致暂时和稳固的硝酸盐积累或特殊的氨基酸库混乱。一些研究利用土壤施用硫肥(硫酸钾、硫磺、亚硫酸氢钠等)的手段，在一定程度上降低了硝酸盐的累积。霍捷等［13］研究发现小白菜叶面喷施NaHSO3，不仅能够在一定程度上提高硝酸还原酶活性(NRA)，拉动氮素的还原同化，而且能够通过提高PSⅡ电子传递能力和羧化反应速率，促进光合碳同化效率，可在碳骨架和能量供应上拉动氮代谢的还原同化。张瑞杰等［14］的研究结果表明，施用硫磺能显著降低土壤的pH值，从而有效地减少了土壤氮的氨挥发损失，可以明显增加土壤含氮量和韭菜产量，同时能有效抑制NH+4向NO－3的转化，降低叶片的硝酸盐累积。叶面喷施水杨酸与土施硫肥配施能否降低硝酸盐含量有待进一步研究。

本试验以韭菜为材料，在前期获得叶面喷施3 mmol/L水杨酸可降低韭菜硝酸盐累积的基础上，以硫直接调控氮代谢或通过调控硫代谢或碳代谢间接调控氮代谢为切入点，采用硫磺(根施)与水杨酸(叶面喷施)配施处理，分析韭菜叶片硝酸盐含量，氮代谢相关酶活性以及叶绿素荧光参数的变化，探讨硫磺与水杨酸配施降低韭菜硝酸盐累积的调控机制，为挖掘积极有效型的蔬菜硝酸盐污染调控措施及氮素高效利用提供理论依据，同时，为绿色蔬菜的栽培提供理论指导，以促进中国无公害蔬菜生产及产业发展。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验于2011年8月在河北省清苑县谢庄日光温室进行，试材为3年生韭菜“新世纪雪韭”，农艺管理按常规进行。试验地土壤为潮褐土，质地粉砂壤，基本理化性状为:有机质17.4 g/kg、全氮1.01 g/kg、全磷0.96 g/kg、缓效钾446 mg/kg、水解氮74.1 mg/kg、速效磷 9.7 mg/kg、硝态氮 9.5 mg/kg、速效钾80.2 mg/kg、有效硫 11.8 mg/kg、pH 7.9、容重1.29 g/cm3。

2011年8月10 日，在前茬韭菜收割后第10 d进行处理，将硫磺(S)和尿素混匀后沟施，施普通尿素240 kg/ha(含 N 46%)，设5个 S水平:0、7.2、18.0、36.0、54.0 kg/hm2，硫磺为分析纯;同时用 3 mmol/L水杨酸对韭菜进行叶面喷雾处理(SA)，每个处理重复3次，以不喷水杨酸为对照(CK)，小区面积2.0 m2。

1.2 测定项目与方法

于处理后第9d上午9点在每小区选取30株生长一致的韭菜，然后将样品立即放入冰盒中进行室内试验。取韭菜相同部位的叶片(从叶柄处向上数第二片叶)，洗净、吸干水分、剪碎混匀后为试验样品。参照植物生理学实验指导采用丙酮－乙醇混合液法测定叶绿素含量［15］

硝酸盐含量的测定［15］:称取2 g韭菜，放入20 mL刻度试管中，加入10 mL蒸馏水，用玻璃泡封口，置于沸水浴中提取30 min。冷却后过滤并用蒸馏水定容至25 mL，吸取提取液0.1 mL，加5%水杨酸—硫酸溶液0.4 mL，混匀后置室温下20 min，加9.5 mL 8%NaOH后摇匀，冷却至室温后，在410 m波长处比色。

可溶性蛋白含量的测定［15］:称取叶片0.5 g，剪碎于冷冻过的研钵中，加3 mL 50 mmol/L Tris－HCl，研磨，将匀浆倒入离心管中，再用 5 mL 50 mmol/L Tris－HCl将匀浆洗入离心管，然后在10000 r/min、4℃条件下离心20 min，取0.1 mL上清液试管中，再加Tris缓冲液0.9 mL，空白对照管加 Tris缓冲液1 mL，然后再加入考马斯亮蓝染色液5 mL，摇匀，在595 nm波长处比色。

酶活性的测定:NRA的测定参照植物生理学实验指导的方法进行［15］，NR以1h内还原NO3－生成NO2－的 μg数表示酶活性，谷氨酸丙酮酸转氨酶(GOT)和谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GPT)活性采用吴良欢等［16］的测定方法。以上酶的提取和测定均在0～4℃条件下完成。

采用德国WALZ公司生产的调制式荧光成像系统(MINI－IMAGING－PAM)进行叶绿素荧光参数测定［17］。韭菜叶片暗适应20 min后，在测量光［强度为 0.5 μmol/(m2·s)，脉冲频率为 1 Hz］下诱导产生初始荧光(Fo)，随后用饱和脉冲光［强度为2500 μmol/(m2·s)，脉冲光时间为 0.8 s］激发产生最大荧光(Fm)。当荧光从最大值降到接近Fo水平时，用光化光［强度为156 μmol/(m2·s)］诱导荧光动力学，并每隔20 s打开饱和脉冲进行荧光参数Fm’和F测定。在每个材料测定光诱导动力学曲线后，从动力学曲线中导出所需要参数数据，进行统计分析。

1.3数据处理

以上所有测定指标重复3次，采用Microsoft Excel 2003软件对数据进行处理及制图，用SPSS 13.0 for Windows软件检验差异显著性，LSD法进行分析。

2 结果与分析

2.1 硫磺(S)和水杨酸(SA)配施对韭菜叶片生长的影响

从表1可以看出，随着硫(S)浓度的增加，对照(CK)和S配施处理的韭菜植株地上部鲜重和叶面积均表现出先上升后下降的变化趋势。当土壤施硫为S 7.2 kg/hm2时，CK和SA配施处理韭菜鲜重均为最高，并且此时SA配施处理与CK相比鲜重增加了10.7%，增加效果最为明显，可见适宜浓度的S与SA配施可以促进韭菜生长，提高产量。

CK和S配施处理的韭菜叶片叶绿素含量均随着硫浓度的增加呈现出先增加后降低的趋势，当S浓度为7.2 kg/hm2时，叶绿素含量达到最大，不施S时，叶绿素含量均为最小值(表1)。说明S与SA配施和单独施S处理均对韭菜叶片叶绿素含量有调节作用，增强了韭菜的叶绿素的合成。不同浓度的S(0、7.2、18.0、36.0、54.0 kg/hm2)与3 mmol/L 的SA配施，韭菜叶片的叶绿素总含量分别比对照(单施硫处理，CK)提高了2.36%、3.19%、2.01%、4.93%和3.78%。

表1 硫磺和水杨酸配施对韭菜生长和叶绿素含量的影响Table 1 Effects of S and SA on the growth and chlorophyll content of Chinese chive

2.2 硫磺(S)和水杨酸(SA)配施对韭菜硝酸盐含量和硝酸还原酶活性(NRA)的影响

由图1可知，对照和SA配施处理韭菜叶片的硝酸盐含量均随着硫浓度的增加呈现出先降低后增加的变化趋势，当土壤施硫为S 7.2 kg/hm2时韭菜硝酸盐含量最低;并且S和SA配施降低韭菜硝酸盐的效果优于S单独施用。NRA是氮素同化的关键酶，单施硫(CK)处理和SA配施处理韭菜叶片的NRA随施硫量的增加表现出与硝酸盐含量相反的变化趋势(图1)，即先升高后降低，当土壤施硫为S 7.2 kg/hm2时，NRA最高，说明适宜浓度的硫可以提高NRA，但当硫浓度过高时会抑制NRA。

图1 硫磺和水杨酸配施对韭菜硝酸盐含量和硝酸还原酶(NR)活性的影响Fig．1 Effects of S and SA on nitrate content and activity of NR of Chinese chive leaves

2.3 硫磺(S)和水杨酸(SA)配施对韭菜谷氨酸丙酮酸转氨酶(GOT)和谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GPT)活性的影响

GOT和GPT为氮代谢中2个重要的转氨酶。SA配施和对照处理后的第9天，随着硫浓度的增加，GOT和GPT活性均表现出逐渐增加的趋势(图2)。另外，从图中还可以看出，在相同硫水平下，SA配施处理的韭菜叶片GOT和GPT活性均高于对照，并且随着硫浓度的增加而逐渐增加，硫浓度为54.0 kg/hm2时GOT和GPT活性升至最高，比CK分别增加了13.6%和9.4%。

［注(Note):SA—叶面喷施3 mmol/L水杨酸Spraying within 3 mmol/L salicylic acid;CK—Spraying water．图中不同字母表示5%水平差异显著Different letters represent significant difference at 5%level．］

2.4 硫磺(S)和水杨酸(SA)配施对韭菜叶片PSⅡ原初光化学效率和电子传递速率的影响

从图3可以看出，随着硫浓度的升高，CK和SA配施处理的韭菜叶片Fv/Fm呈现出先增加后降低的趋势，但CK处理的变化幅度较小。另外，与CK相比，SA配施处理提高了韭菜叶片的Fv/Fm，当硫的浓度为7.2 kg/hm2时Fv/Fm的增加效果最为明显。反映出SA配施处理能保证韭菜叶片具有较高的能量转化效率，为叶片的生长发育提供了更多的化学能，进而促进叶片内部的物质代谢。

图3结果还表明，SA配施处理显著提高了韭菜叶片的 ETR，不同浓度的 S(0、7.2、18.0、36.0、54.0 kg/hm2)与3 mmol/L的SA配施，其ETR分别比CK提高了23.3%、21.20%、27.11%、19.38%和14.16%。并且，随着硫浓度的增加，SA配施和CK处理的韭菜叶片的ETR均随着硫浓度的增加呈现先上升后下降的趋势。

图3 硫磺和水杨酸配施对韭菜叶片Fv/Fm和ETR的影响Fig．3 Effects of S and SA on Fv/Fm and ETR of Chinese chive leaves

2.5 硫磺(S)和水杨酸(SA)配施对韭菜可溶性蛋白含量和干物质积累的影响

图4显示，韭菜叶片的可溶性蛋白含量随硫浓度的增加而增加，S浓度为 7.2、18.0、36.0、54.0 kg/hm2的处理比0 kg/hm2分别提高了13.9%，9.9%，6.6%和5.2%，反映出施硫可提高代谢所需的酶，从而促进了韭菜叶片的物质代谢。另外，SA配施处理也提高了不同硫水平下韭菜叶片的可溶性蛋白含量，除S浓度为0 kg/hm2和7.2 kg/hm2两处理外，可溶性蛋白增加的效果显著。

图4 硫磺和水杨酸配施对韭菜叶片可溶性蛋白含量和干物质积累的影响Fig．4 Effects of S and SA on the soluble protein content and dry weight of Chinese chive leaves

植物的干重在一定程度上可以反映植物在一段时间内的干物质积累量。本试验中，不同硫水平下的韭菜幼苗干重随着硫浓度的增加也表现出逐渐呈增加的趋势(图4)，其中，在S浓度为7.2和18.0 kg/hm2时增加效果最为明显，分别比0 kg/hm2提高了16.04%和13.44%。另外，与CK相比，水杨酸配施处理也提高了韭菜叶片的干物质积累量，但增加效果无明显的规律性。

3 讨论与结论

前人研究表明，植物体的氮素同化和硫素同化过程彼此依赖，相互协调［10］，氮硫配合施用可显著增加植株干物质产量，氮、硫含量和吸收量［18］，但植株内氮、硫含量及其比值受基因型和氮、硫供给水平的影响［19］。周杰等［18］认为氮素和硫素在适量范围内，二者存在互促效应，供应水平过高，则相互抑制，不利于小麦对氮、硫的吸收和利用。朱云集［20］的研究认为，在较高施氮量条件下适当施硫有利于小麦籽粒产量的提高，而在低氮条件下施氮施硫会导致减产。本试验结果表明，在240 kg/hm2尿素水平下，施硫均可降低韭菜硝酸盐含量，提高韭菜的可溶性蛋白含量和干物重，且当硫浓度为7.2 kg/hm2时的效果最为明显，说明适宜的氮、硫供应可能促进了韭菜体内的氮、硫代谢平衡，推动了氮素的还原同化及蛋白质的合成。

在氮代谢(NO－3→NO2－→NH+4→谷氨酰胺→谷氨酸→氨基酸→蛋白质)的整个途径中，NR作为重要的调节酶和限速关键酶，由它来调控整个氮素还原同化进程［21］。一些研究利用土壤施用硫肥(硫酸钾、硫磺等)的手段，在一定程度上调节植株氮、硫代谢过程中的关键酶活性［22］，同时促进植株的碳－氮(C－N)运转，提高植株对氮的吸收利用。本试验中，硫磺(S)与水杨酸(SA)配施和硫单施处理韭菜叶片硝酸还原酶活性(NRA)均随着硫浓度的增加呈现出先上升后下降的趋势，说明适宜浓度的硫有促进韭菜叶片硝酸还原酶的生成和激活作用，而硫浓度过高反而会降低NRA，可能是由于硫浓度过高会导致氮、硫同化竞争活化能量，表现出对硝酸还原酶的抑制，从而影响植物氮代谢的顺利进行［22］。SA在植物信号传导和抗逆反应中起着关键作用［23］，在一定浓度范围内还可以调节根系离子的吸收和转运，诱导NR活性［9］，对氮素的吸收和还原起到积极的推动作用，本试验中S和SA配施韭菜叶片NR活性均比硫单独施用高，在提高氮还原动力泵NR活性上表现出较高的协同效应，反映了SA对推动氮素的还原，减少韭菜的NO3－累积发挥了重要作用。NR活性的提高可能是由于SA和S的直接作用，也可能是因为两者配施影响植物激素［细胞分裂素(CTK)和生长素(IAA)］代谢而产生的间接作用，还可能是发生在NR mRNA转录水平上［24］。

尽管在整个氮代谢途径中硝酸还原酶(NR)为限速关键酶，但是还需要铵同化、呼吸作用和光合作用［提供的还原能力(NADH/NADPH/Fd)、ATP和C－骨架］、以及转氨作用(继谷氨酸转氨作用后形成其它氮转运氨基酸状况)的协同配合［9］。

植物细胞为避免NH+4的毒害作用，会迅速将由NH+4通过谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶(GS/GOGAT)循环转移到谷氨酸，然后在GOT和GPT等转氨酶的催化作用下转化为其他氨基酸。朱云集等［22］研究结果表明，在适量供氮条件下，施硫不会引起硫同化酶活性的升高，但可调节氮同化酶的活性，维持小麦植株体内氮素和硫素同化在适度水平，以满足其生理代谢的需求。本研究中，随着硫浓度的增加，GPT和GOT活性均呈现逐渐增加的趋势，GOT和GPT活性的提高对保证氮的同化有积极的作用。尤其是在高硫浓度和NRA较低的情况下，S和SA配施处理促进了氮同化和转氨作用的协同进行，从而拉动了氮素的还原，减少了韭菜的硝酸盐累积。

硫是叶绿素、辅酶等合成的重要介质，它能提高叶绿素体内铁的活性，增加叶绿素含量，另外，硫构成参与光合作用过程的硫氧还蛋白、铁硫蛋白(FeS)、Rieske氏铁硫蛋白和铁氧还蛋白(Fd)等，参与光合电子的传递，促进形成暗反应的同化力ATP和NADPH［25］。本研究获得S和SA配施可提高韭菜叶片叶绿素含量的结果，并且还可促进PSⅡ的光能吸收与传递更多的能量，为氮代谢(如亚硝酸盐还原和氨同化)和硫代谢(如硫酸盐还原)等提供充裕的能量，提高光合效率。光合作用的改善对提高生物累积量、可溶性糖、C－骨架和韭菜产量奠定了基础。另外，S和SA配施后韭菜叶片生长量增大，对硝态氮产生了稀释效应，使单位重量蔬菜的NO3－含量下降，从而降低了硝酸盐的累积。

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