半夏镇咳祛痰的成分-效应关系研究△

曾颂，李书渊，吴志坚，黄玉梅，陈艳芬*，杨全，陈伟民，苏彬

(1.广东药学院 中药学院，广东 广州 510006；2.广州市药材公司 中药饮片厂，广东 广州 510360)

半夏镇咳祛痰的成分-效应关系研究△

曾颂1，李书渊1，吴志坚2，黄玉梅2，陈艳芬1*，杨全1，陈伟民1，苏彬1

(1.广东药学院 中药学院，广东 广州 510006；2.广州市药材公司 中药饮片厂，广东 广州 510360)

目的：基于灰色关联法评价半夏主要成分与镇咳祛痰效应之间的关系，为半夏质量控制的指标选择提供依据。方法：测定生半夏及其炮制品中3种主要成分(生物碱、多糖、有机酸)的含量，运用小鼠镇咳、祛痰药理模型评价半夏不同炮制品的药效，采用灰色关联法将两者数据相关联，评价半夏镇咳祛痰的成分与效应之间的关系。结果：与半夏镇咳祛痰作用关联的成分关联度大小排序依次为：生物碱>多糖>有机酸。结论：半夏中总生物碱与镇咳祛痰作用的相关性最大，初步确认可以生物碱为指标建立半夏药材的质量控制标准。

半夏；成分；药理效应；灰色关联法

半夏为天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb.)Breit.的干燥块茎，始载于《神农本草经》，列为下品[1]，历代本草均有收载，为我国常用毒性中药[2]。半夏味辛，性温，有毒，归脾、胃、肺经，具有燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结功能，用于湿痰寒痰，咳喘痰多，痰饮眩悸，风痰眩晕，痰厥头痛，呕吐反胃，胸脘痞闷，梅核气；外治痈肿痰核[3]。研究表明半夏的主要有效成分总游离有机酸具有止咳化痰、止呕功效，并对胃癌细胞有抑制作用[4]；半夏总生物碱有止呕和抗炎作用，其总生物碱含量高低直接影响药材的质量和疗效[5]；半夏多糖有抗肿瘤作用，它具有激活网状内皮系统活性[6]，可抑制肿瘤的发生和增殖[7]，并且具有清除羟自由基的能力[8]。本研究运用灰色关联法评价半夏中生物碱、有机酸、多糖与半夏传统功效之间的关系，筛选合理的指标成分，为建立评价半夏药材质量的方法提供依据。

1 材料

1.1 药物

生半夏(批号：S20111020，产地：四川，广州市药材公司中药饮片厂)。法半夏(批号：F20111020)；清半夏(批号：Q20111020)；姜半夏(批号：J20111020)，分别由同一批次生半夏依照《中国药典》2010版一部“法半夏”、“清半夏”、“姜半夏”项下制法炮制而成。经广东药学院李书渊教授鉴定为天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb.)Breit.的干燥块茎。取以上各样品粉末200 g，加入8倍量的水，煎煮，保持微沸1 h后，纱布滤过，得滤液，浓缩待用，给药前配制成每1 mL含生药0.15 g的混悬液。

阳性对照药：镇咳实验采用枸橼酸喷托维林片(规格：25 mg/片，长春迪瑞制药有限公司，批号：100101)，实验时配成1.67 mg·mL-1；祛痰实验采用羧甲司坦片(广州白云山制药股份有限公司，批号：1103041)，实验时配成25 mg·mL-1。

D-无水葡萄糖对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110833-200503)；盐酸麻黄碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号：0090-9801)。

1.2 主要试剂

苯酚红(分析纯，天津市科密欧化学试剂中心，批号：200402025)；氯化钠(分析纯，天津市百世化工有限公司，批号：20100420)；碳酸氢钠(化学纯，广东光华化学厂有限公司，批号：20060613)；氨水(分析纯，广州化学制剂厂，批号：20110401-1)；98%浓硫酸(分析纯，北京化学试剂厂，批号：20120506)；苯酚(分析纯，天津市永大化学试剂有限公司，批号：20120207)；95%乙醇(分析纯，天津市百世化工有限公司，批号：20120706)；三氯甲烷(分析纯，广州化学试剂厂，批号：20120502-2)；溴百里香酚蓝指示剂(天津市天新精细化工开发中心，批号：20110406)。

1.3 仪器

Techcomp MaxTitra 30M自动电位滴定仪(大连天美科学仪器有限公司)；SHIMADZU，UV-2450紫外可见分光光度计(日本岛津)；Sartorious，BP211D十万分之一电子天平(德国赛多利斯)；SHIMADZU，AY120万分之一电子天平(日本岛津)；飞鸽牌TDL80-2B离心机(上海安亭科学仪器厂)；WH-2000轻便型超声雾化器(广东粤华医疗器械厂)。

1.4 动物

实验动物选用KM小鼠，许可证号：SCXK(粤)2008-0020，SPF级，雌雄各半，体重18～22 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，正常饲养3 d后供试。

2 方法与结果

2.1 有机酸、生物碱和多糖的含量测定

按《中国药典》2010版一部“半夏”项下“含量测定”方法，采用电位滴定法，对生半夏及其炮制品的有机酸进行含量测定[3]；以盐酸麻黄碱为对照品，采用酸性染料比色法，测定吸光度，按照回归方程计算含量，对生半夏及其炮制品的生物碱进行含量测定[9]；以D-无水葡萄糖为对照品，采用硫酸-苯酚法显色后用分光光度计测定吸光度，对生半夏及其炮制品的多糖进行含量测定，按照回归方程计算含量[10]。结果见表1。

表1 生半夏及其炮制品有机酸、总生物碱、总多糖的含量n=5) /%

2.2 半夏不同炮制品的镇咳祛痰实验

2.2.1 镇咳实验 参考文献方法[11]，取KM小鼠，雌雄各半，随机分组。各实验组每日灌胃给药1次，连续灌胃5 d。末次给药1 h后，将小鼠置于氨水引咳装置中制备咳嗽模型。喷雾15 s，立即取出小鼠，记录引咳潜伏期和3 min内的咳嗽次数，见表2。

2.2.2 祛痰实验 KM小鼠，雌雄各半，随机分组。各实验组每日灌胃给药1次，连续灌胃5 d，末次给药30 min后，小鼠腹腔注射0.5%酚红0.9%氯化钠溶液，0.2 mL·(10g)-1，注射30 min后脱臼处死，然后小鼠仰位固定于手术板上，剪开颈正中皮肤，分离气管，以注射器吸取5% NaHCO3溶液0.5 mL推注入气管内，通过针头来回灌洗呼吸道3次，收集灌洗液，2 000 r·min-1离心5 min，取上清液，采用分光光度计于波长558 nm测定其光密度(OD值)，根据酚红标准曲线回归方程计算其酚红浓度，见表2。

从表2结果可见，与空白对照组比较，半夏各种制品不同程度延长小鼠咳嗽潜伏期，差异有统计学意义。生半夏、姜半夏、法半夏均可减少小鼠咳嗽次数，姜半夏还能明显增加气管酚红排泌量，具有祛痰作用。

表2 生半夏及其炮制品的镇咳祛痰作用n=12)

注：与空白对照组相比，*P<0.05；**P<0.01

2.3 灰色关联度方法

2.3.1 参考序列的选择 设有n个样品，每个样品有m项含量评价指标，即组成子序列{Xki}，(i=1，2，3……n；k=1，2，3……m；本研究中n=4，m=3)。其中，“咳嗽潜伏期”和“酚红排泌量”与供试药物效力(有效成分含量)为正相关关系；而“咳嗽次数”与供试药物效力(有效成分含量)为负相关关系，故先将“咳嗽次数”的值转化为倒数化像。定义药理指标“潜伏期”、“咳嗽次数”、“酚红排泌量”为母序列{Xoi}，依次分别为{Xoi}潜，{Xoi}咳和{Xoi}酚(i=1，2，3……n)。

2.3.2 原始数据规格化处理 由于评价指标间存在测度单位不统一和各含量指标间独立性的问题，且需要将负相关因素转化为正相关因素，因此需要将子序列和母序列的原始数据按公式(1)进行处理，见表3。

表3 子序列和母序列数据规格化

2.3.3 计算关联系数 经数据规格化后的母序列记为{Yoi}，子序列记为{Yki}，则母序列{Yoi}与子序列{Yki}的关联系数Loki，可由公式(2)计算，见表4～6。

Loki=(Δmin+ρΔmax)/(Δoki+ρΔmax)

(2)

式中Loki表示两比较序列的关联系数；Δoki=|Yoi-Yki|(1≤i≤n)；Δmin和Δmax分别表示两比较序列中差的绝对值中的最小值与最大值。因为比较序列相交，故取Δmin=0；ρ称为分辨系数，其意义是削弱最大差的绝对值太大引起的失真，提高关联系数之间的差异显著性，ρ∈(0，1)，本研究选取0.8。关联系数反映两个被比较序列的靠近程度。

表4 相对于潜伏期{Xoi}潜母序列的各关联系数计算结果

表5 相对于咳嗽次数{Xoi}咳母序列的各关联系数计算结果

表6 相对于酚红排泌量{Xoi}酚母序列的各关联系数计算结果

2.3.4 计算关联度 按公式(3)计算，见表7。

(3)

ri(o)为子序列{Xki}与母序列{Xoi}的关联度，n为比较序列的数据个数。ri(o)愈大，表明子序列与母序列的关联程度愈甚，对药理效应的贡献就越大。

表7 相对于各母序列的关联度及关联度排序

3 讨论

灰色关联度分析来自灰色系统理论。其基本思想是一种相对性的排序分析，根据序列曲线几何形状的相似程度来判断其联系是否紧密。如果一组几何曲线形状越相似关联度越大，反之则越小，由此从所考察的复杂系统中找出主次因素，为系统综合决策及提高综合效益提供信息。也就是说两者在发展过程中相对变化基本一致，则认为两者关联度大，反之，两者关联度小。设有n个中药样品，每个样品有m项特征量化指标，这样构成了m个子序列。以样品药效学指标作为母序列，依据母序列与子序列关联度的大小，可确定诸特征对药效贡献的大小[12-13]。

基于灰色关联度法的思想，本研究通过测定炮制前后半夏中3种有效成分有机酸、生物碱和多糖的含量，并进行镇咳祛痰的药理作用评价，建立以相对关联度为测度，将成分的含量测定结果与药理作用评价结果相联系，从而研究半夏药材中对传统功效贡献大的成分，为选择指标成分提供依据。根据实验结果关联度排序大小，生物碱均排在第一位，确定半夏药材中生物碱对镇咳祛痰作用贡献程度最大。综上所述，本研究初步认为可以生物碱为指标性成分建立半夏药材质量控制标准。

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Ingredients-effectRelationshipStudyonAntitussiveandExpectorantofPinelliaeRhizoma

ZENG Song1，LI Shu-yuan1，WU Zhi-jian2，HUANG Yu-mei2，CHEN Yan-fen1*，YANG Quan1，CHEN Wei-min1，SU Bin1

(1.(SchoolofChinesemedicine，GuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou，510006，China；2.GuangzhouMateriaMedicaCompany，Guangzhou510360，China)

Objective:To study ingredients-effect relationship of Pinelliae Rhizoma by the Grey incidence degree method，and provide the basis for the indicators of its quality control.Methods：Gray Model was sated up by quantitating the three main ingredients(alkaloids，polysaccharides，and organic acids)and using the antitussive and expectorant pharmacological model to evaluate the effects of Pinelliae Rhizoma and its processed products.Results：The size sort of Grey incidence degree associated with antitussive and expectorant ingredients：alkaloids>organic acids>polysaccharides.Conclusion：As to antitussive and expectorant effect，alkaloids were the most effective ingredient，which could be recognized as indicator for Pinelliae Rhizoma quality control.

Pinelliae Rhizoma； Ingredient； Pharmacologic effect； Grey incidence degree method

2013-01-08)

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广州市荔湾区技术研究与开发项目(20114813042)，广东药学院2012年校级大学生创新实验项目

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陈艳芬，Tel:(020)39352180，E-mail：xwnai@163.com