不同产地肾茶HPLC指纹图谱研究△

李光，陈曦，李宜航，李学兰

(1.中国医学科学院 药用植物研究所 云南分所，云南 景洪 666100；2.西双版纳州傣药南药重点实验室，云南 景洪 666100；3.中国医学科学院 药用植物研究所，北京 100193)

不同产地肾茶HPLC指纹图谱研究△

李光1,2*，陈曦1,3，李宜航1,2，李学兰1,2

(1.中国医学科学院 药用植物研究所 云南分所，云南 景洪 666100；2.西双版纳州傣药南药重点实验室，云南 景洪 666100；3.中国医学科学院 药用植物研究所，北京 100193)

目的：建立肾茶药材的HPLC指纹图谱分析方法。方法：采用Waters ODS柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水(含0.1%的磷酸)，梯度洗脱，检测波长为205 nm，流速为1 mL·min-1。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)版》，计算不同产地肾茶样品的HPLC指纹图谱的整体相似度。结果：共有15个共有峰，13批被测样品的色谱指纹图谱与对照指纹图谱的整体相似度在0.908～0.985。结论：该指纹图谱检测方法简便、重现性好，可作为肾茶药材质量控制的重要方法。

肾茶；指纹图谱；高效液相色谱

肾茶Clerodendranthusspicatus(Thunb.)C.Y.Wu又名猫须草，为唇形科肾茶属多年生草本植物，是傣医药中常用的解药(排解人体内积蓄毒素的药物)品种，也是傣医用于预防和治疗肾、膀胱、尿道疾病的首选药材，在西双版纳地区广泛种植，《贝叶经》(傣医经典论著)中记载其可单方煎汤或开水浸泡当茶饮，具有清热解毒，利水消肿，利尿化石，养肾保肾，凉血止血等功能。近年来，随着国内外学者深入研究，发现肾茶的药理作用不仅仅应用于泌尿系统，同时具有抗炎[1]、降血糖血脂[2]、保肝[3]、提高机体免疫力[4]等一系列药理活性，功效作用明确。随着以肾茶为原料的保健产品及药品的开发，原药材质量控制变得尤为重要，肾茶主产地遍布广西、海南、云南、东南亚等地，同属种类较多，简单来讲分为白花和紫花之分，西双版纳地区使用品种为白花样品，也有报道临床紫花品种质量优于白花品种，所以质量问题亟待解决。

在现阶段，指纹图谱技术是全面、整体地控制中药质量最有效的方法。至目前，未曾见有关肾茶指纹图谱方面的文献报道，为更有效地控制肾茶的质量，实验参照文献[5]应用RP-HPLC方法，建立了肾茶的HPLC指纹图谱分析方法，为其药材鉴别和质量控制提供实验依据。

1 材料、试剂与仪器

1.1 材料与试剂

肾茶样品的产地具体情况见表1。迷迭香酸对照品(批号：ZL20110523MDXS，南京泽朗医药科技有限公司)。乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)，其余试剂均为分析纯。

表1 13批肾茶药材的样品信息

1.2 仪器

Waters 600高效液相色谱仪配Waters 2489紫外检测器，Empower色谱工作站(美国沃特世公司)；菲罗门ODS柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，超声提取器(上海仪器制造厂，SK3200H)，电子天平(德国赛多利斯，CP-224S)，超声清洗仪(宁波市海曙五方超声设备有限公司，WF-500E)，遗传性超纯水仪(英国ELGA公司，ULTRAGE MK2)。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的配制

精密称取迷迭香酸对照品3.55 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得迷迭香酸浓度均为0.355 mg·mL-1的对照品溶液。

2.2 供试品溶液的配制

分别取肾茶粉末(过60目筛)约500 mg，精密称定，置于25 mL量瓶中，加入50%甲醇10 mL，在常温下超声(250 W，40 kHz)提取30 min，过滤，滤液蒸干，加甲醇溶解定容至10 mL，即得供试品溶液。进样前取适量溶液用0.45 μm微孔滤膜过滤。

2.3 色谱条件和系统适用性试验

色谱柱：菲罗门ODS柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-水(含0.1%磷酸)为流动相，梯度洗脱(见表2)，流速：1 mL·min-1，柱温：40 ℃，检测波长：205 nm。在上述色谱条件下，按迷迭香酸峰计算理论板数不低于4 000，与其他色谱峰的分离度大于1.0。

表2 梯度洗脱程序

2.4 标准曲线制备

精密称取迷迭香酸对照品8.875 mg，置25 mL容量瓶中，水溶解定容，在2.3项色谱条件下分别进样1，2，4，6，8，10 μL，以浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，建立标准曲线，得到迷迭香酸对照品的回归方程为Y=106X+52 387，r=0.999 8，显示迷迭香酸在0.348 6～3.486 μg呈现良好线性关系。

2.5 精密度试验

取同一供试品溶液，连续进样6次，分别对共有峰的保留时间和峰面积比值进行考察。结果表明，各共有峰保留时间的RSD<1.9%，峰面积的RSD<2.3%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一批样品6份，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，分别进样测定各共有峰保留时间的RSD<1.8%，峰面积的RSD<3.0%，表明实验方法重现性良好。

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，室温放置，分别于0，2，4，8，16，24 h进样，测定各共有峰保留时间的RSD<1.2%，峰面积的RSD<2.8%，说明样品稳定性良好。

2.8 肾茶药材指纹图谱建立

取肾茶药材(1～13号样品)，按2.2项下方法制备供试品溶液，各取20 μL分别进样，进行HPLC分析；另取迷迭香酸对照品溶液按相同条件进行分析，根据相对保留时间对样品图谱中色谱峰进行归属，并以迷迭香酸色谱峰为参比峰，共得到17个共有峰，结果如图1所示，将指纹图谱信号数据导入2004A版相似度评价软件，生成共有模式即对照指纹图谱，见图2。

A.迷迭香酸对照品；B.肾茶图1 肾茶及对照品HPLC指纹图谱

2.8.1 指纹图谱及共有指纹峰的标定 按照对照品溶液和供试品溶液的制备方法制备样品溶液，并对对照品(见图1)和13个批次供试品的HPLC图进行检测。结果表明1～17号峰在13批次样品的色谱图中均出现，以迷迭香酸为参照，即11号峰，计算共有峰保留时间分别为2.956、12.525、13.577、13.978、14.295、14.696、15.665、17.234、17.802、18.303、18.678、20.290、21.226、22.695、23.363、39.045、40.364、42.334，共有指纹峰峰面积之和占总峰面积比值均大于90%，符合《中药指纹图谱研究技术指南(试行)》的要求。因此标定此17个峰为共有指纹峰，并据此建立了肾茶的HPLC指纹图谱，见图2。

2.8.2 相似度比较 采用中药指纹图谱相似度评价系统软件，对13批肾茶样品图谱进行相似度比较。以生成对照指纹图谱为模板，13批样品与对照指纹图谱之间相似度为0.908～0.985，见表3。

图2 13批肾茶药材指纹图谱

表3 肾茶药材共有峰的相对保留时间

2.8.3 肾茶品质评价 测定13批不同来源肾茶的HPLC指纹图谱，并与共有模式图谱进行比较，计算相似度，以相似度作为优质药材的定量判定标准，见表4。

结果表明，由相似度可以看出，以福建鼓浪屿的紫花肾茶相似度最高，为0.985，紫花与白花肾茶平均相似度分别为0.966 2和0.951 7，说明紫花肾茶较白花肾茶质量更加稳定；由迷迭香酸含量可以看出，以云南景洪市药植所的紫花肾茶含量最高，为1.51%，紫花与白花肾茶迷迭香酸含量平均为0.94%和0.92%，说明紫花肾茶有效成分含量要优于白花肾茶。综合上述，云南地区的紫花肾茶可能为优质品种，药理作用是否更好，还待下一步研究。

表4 13批肾茶来源及HPLC指纹图谱相似度

3 讨论

实验对乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.5%醋酸水溶液和乙腈-1%醋酸水溶液系统进行了考察，结果发现只有在乙腈-0.1%磷酸水溶液系统下保留时间较适合且峰形较好，所以将乙腈-0.1%磷酸水溶液系统确定为流动相。

实验对检测波长进行了考察，记录并比较了不同波长的指纹图谱，结果在205 nm检测波长下，指纹图谱中色谱峰较多，信息较丰富，所以选择205 nm为检测波长。

通过比较紫花肾茶与白花肾茶的平均相似度，发现紫花肾茶优于白花肾茶，这也为临床用药提供了技术参考。

实验采用HPLC技术对肾茶样品中黄酮类化合物进行了检测，通过对13批次肾茶样品色谱峰保留时间和峰面积百分比的比较和分析，对共有指纹峰进行了标定，并据此成功建立了肾茶药材的HPLC指纹图谱。经过对不同产地肾茶样品的HPLC图谱的比较，结果表明，实验获得的色谱指纹图谱在不同产地肾茶样品中具有极大的相似性，从而可以有效反映同一物种个体间的相似性，可以作为肾茶专属性的指纹图谱，为肾茶的药材鉴别和质量控制提供依据。

[1] 高南南，田泽，李玲玲，等.肾茶药理作用的研究[J].中草药，1996，27(10)：615.

[2] Mohamed E A H，Mohamed A J，Asmawi M.Antihyperglycemic Effect of Orthosiphon Stamineus Benth Leaves Extract and Its Bioassay-Guided Fractions[J].Molecules，2011，16(5)：3787-3801.

[3] Mohammed A.Hepatoprotective Effects of Orthosiphon stamineus Extract on Thioacetamide-Induced Liver Cirrhosis in Rats[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2011，(1)：1-6.

[4] 岑小波，王瑞淑.肾茶对小鼠免疫功能的影响[J].现代预防医学，1997，(1)：78-79.

[5] 陈志红，徐美奕，龚先玲.紫荆花黄酮类化合物的HPLC指纹图谱研究[J].中国药房，2010，(31)：2927-2928.

HPLCFingerprintofDifferentOriginOrthosiphonstamineus

LI Guang1,2*，CHEN Xi1，3，LI Yi-hang1,2，LI Xue-lan1,2

(1.YunnanBranch，InstituteofMedicinalPlant，ChineseAcademyofMedicalSciences，PekingUnionMedicalCollege，Jinghong666100，China；2.KeyLaboratoryofDaiandSouthernMedicineofXishuangbannaDaiAutonomousPrefecture,Jinghong666100 ,China; 3.InstituteofMedicinalPlant,ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege,Beijing100193 ,China)

Objective:To establish the analysis method of fingerprint forOrthosiphonstamineusby HPLC.Methods：A column of Waters ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm)was used.The mobile phase consisted of acetonitrile-water(containing 2% acetic acid)with gradient elution. The detective wavelength was 205 nm，and the flow rate was 1.0 mL·min-1.The similarity of different originalOrthosiphonstamineussamples were compared by Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of CMM Version 2004A.Results：The fingerprint consisted of 15 common peaks.And the similarity was in the range of 0.908～0.985.Conclusion：This method is simple，accurate，and with good reproducibility，can be used specifically for the quality control ofOrthosiphonstamineus.

Orthosiphonstamineus； Fingerprint； HPLC

2012-11-20)

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中国医学科学院北京协和医学院青年科研基金项目(XHYN-01),中央级公益性科研院所基本科研业务专项(YZYN-11-03)，云南省科技重大项目——傣药南药特色资源评价及保育技术研究(2008IF018)

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李光，Tel：(0691)2136981，E-mail：lhbg311@hotmail.com