猪场疫病实验室检验的应用分析与建议：病原检测

朱秀高

（武汉回盛生物科技有限公司，湖北武汉430042）

近年来随着人们养猪规模的扩大及国外引种数量的增长，人们发现虽然我们的养殖硬件设施在不断提高、养猪人员的经验和学历水平在不断增加，但还是有一些新的疾病持续出现，如高致病性蓝耳病、圆环病毒病，也有一些原来仅存在于课本中的疾病开始出现于我们的猪群中，并造成严重危害，如副猪嗜血杆菌病、传染性萎缩性鼻炎和回肠炎，同时多种疾病导致的混合感染已经成为当前猪场中所面临的主要威胁，如高热病、仔猪原因不明性腹泻和呼吸道疾病综合征等。

众所周知，在应对疾病时，特别是当猪群发生疾病时，正确的诊断应当是采取进一步措施的必要前提。在国内80年代之前的养殖环境中，有经验的兽医单凭对某几个特殊临床症状的观察就能确诊猪只所发疾病，并采取相应有效的治疗措施，但随着近年来混合感染的出现，单凭临床观察，甚至配合病理剖检都不能再100%确诊猪只所患疾病种类，因此为了提高诊断的准确性，为治疗和预防措施的制定与实施提供参考，一些有条件猪场开始采取与科研单位合作或自己建立实验室的方式，进行疾病的实验室诊断，但我们在与猪场交流过程中发现，由于实验室检验方式的专业性要求较高，因此除了一些超大规模化猪场外，很多猪场在面对如何进行实验室检验，特别是在如何解读检验报告方面，欠缺很大，甚至由此造成很多不必要的误会和对实验室检验的不信任。为了使大家能够对实验室检验所用方法有一个清晰的认识，特别是能够学会如何正确的阅读与分析检验报告，本文主要集中于病原检测即针对病原检验所用方法的讨论与分析。

病原，顾名思义即导致发病的原因，针对于传染病来说主要是指细菌、病毒等各类微生物，从检测的项目来分，目前实验室中针对微生物检验所用的方法可以划分为直接法和间接法两种，其中直接法中含有专门针对细菌的培养法和针对各类病原的PCR法，间接法主要是指野毒抗体检测法。

1 直接法

直接法是指通过直接对微生物本体或其某一组分的检验，来达到测定样品中某一特定微生物的有无及其含量的一类方法。

1.1 培养法

严格来说培养法中包含对细菌和病毒两类病原体的培养，但一般猪场所能用到的培养仅有针对细菌的培养，因此本叙述中，以细菌培养为主要对象进行讨论。

临床上一个较为完备的细菌培养流程，需要配备以下几种简单设备：无菌操作台、酒精灯、接种环、培养箱、显微镜、常规染色剂及培养板，其中培养板可以购买商业化培养皿或自己制作。

当怀疑发病猪只存在细菌感染时，需要根据经验初步判断培养所需的特殊培养皿或通用培养皿，并对培养条件进行准备。将病料组织接种于培养皿时，最好进行无菌操作，接种后的平皿应详细编号记录，并在培养过程中定期做好观察，一般培养24小时（特殊细菌除外）即可见到有明显的菌落长出，接下来的工作就是要通过对菌落形态和细菌染色后的镜检，判断感染细菌的种类，如果有条件还可以进行如生化鉴定、攻毒实验等方法来确定。

采用传统培养法进行细菌鉴定时，经验是实验能够成功及准确与否的关键因素，因为这一流程中的很多环节需要通过人的主观意识来进行评判，如细菌的生长情况、菌落的特征、染色的操作和显微镜的检查等。为了进一步提高细菌培养检查的准确性与客观性，同时提高操作的简单性，目前已经开发出了一些细菌鉴定系统，这些系统主要是通过对细菌在培养过程中所表现出来各项特性的评分，来达到最终确认该细菌属于哪种类别的目的。从应用来看，此类系统的准确性较高，且操作简单。建议猪场如果有条件，在建立自己的实验室时，还是应以购入此类系统为主。

1.2 PCR法

PCR法是分子生物学方法的一种，也是微生物分子生物学分析流程的关键环节，其理论依据是微生物分子核酸序列的专一性和特异性，根据测定对象及过程的区别可以分为普通PCR方法（针对DNA）和RT-PCR方法（针对RNA）两类，能够实现对细菌、病毒、支原体等各类微生物性病原的检测。该方法操作相对简单，但如果要进行结果解读及问题分析则需要较深的理论知识。

临床上该方法的应用，所需设备及试剂价格高昂，且对实验条件和实验人员要求较高。一般来说所需设备主要有PCR仪、电泳仪、紫外仪、超净台、冷冻离心机等，另外还需要建立专用的操作间，以防样品交叉污染和对人体产生损害。试剂方面，由于自配试剂的不稳定性，现在多倾向于使用商品化试剂盒，不过商品化试剂盒的批间差异性和品牌差异性，也给该方法的应用及结果间的比较带来困难。人员方面，一般认为该方法能够实现流程化操作，所需人员只需能熟练操作即可，其实不然，由于该方法环节众多，且易出现假阳性、假阴性等情况，如果操作人员没有一定的分子生物学背景，则很难对这些情况的出现给出合理解释，并提出解决方案。所以如果猪场想要建立自己的PCR诊断实验室，个人认为，首先就是要做好选人工作，其次才是各类设备的采购与制度建设。

2 间接法

间接法即测定的核心目的是检查病原的有无，但由于没有合适的直接法或直接法操作复杂，因此通过测定其他能够反映病原的项目来判断病原是否存在。最常见的间接法测定病原是各类野毒抗体检测法，即通过对体内野毒抗体的测定来判断动物机体是否存在野毒病原感染。如伪狂犬gE-ELISA抗体测定法和蓝耳病野毒抗体测定法。

采用此类方法的关键是要有合适的基因缺失疫苗与相应的基因抗体检测试剂盒，两者缺一不可，目前仅有伪狂犬病、蓝耳病及猪瘟（国内没有）能够实现用该方法检测。由于每种试剂盒的检测项目判断标准不一，所以猪场在自己应用测定时，应于实验前仔细阅读其说明，并严格按照说明书要求操作与计算，以保证实验结果的准确性。

前已述及，基于病原检测的准确性诊断是采取进一步措施治疗猪病的前提。猪场不管是与科研院所合作进行代检，还是建立自己的专有实验室，其中关键性的一环就是要选择合适的方法，同时要对该方法有较为全面的了解，特别是对于自建实验室来说，应以准确、操作方便、实用为主要考虑，而没有必要一味的追求高精尖。