水样中铅离子含量的测定——介绍一个分析化学研究型教学实验

白金燕 马福祥 贺兰 金燕

(陕西师范大学化学化工学院 陕西西安 710062)

为了培养本科生的实践能力与探索新知的精神，在基础分析化学实验中增设了研究型实验，让学生根据自己的兴趣选择指导教师，开展研究工作。目前环境污染和食品安全方面的问题引起大家的广泛关注，学生对于利用所学知识进行环境污染监测也非常感兴趣。铅在工业中的用途很广，同时铅在自然界中普遍存在，又因为其具有不可降解性和生物富集效应，故易导致铅污染。铅能作用于人的全身系统和器官，危及神经、消化器官、心血管、肾脏等[1-4]。因此，建立简单、灵敏、快速检测铅离子的方法，对食品安全和环境监测有重要意义。在查阅文献的基础上，我们设计了利用荧光探针与DNA作用导致荧光信号改变检测水样中铅离子的实验。该实验有助于学生了解科学研究工作的基本过程，培养学生查阅、归纳总结文献的能力，分析与解决问题的能力，数据分析能力及科技论文写作能力。

1 实验原理

结晶紫属于三苯甲烷类染料，分子内容易发生电荷转移，导致平面结构发生扭曲，光活性降低。结晶紫本身荧光信号很弱，而当结晶紫与单链凝血酶DNA适体混合后，其荧光信号将有所增强。在铅离子存在条件下，单链凝血酶DNA适体发生构型改变，形成四链体DNA，可导致体系的荧光信号显著增强。利用这种基于结晶紫与不同结构的凝血酶适体作用方式的差异而引起的荧光信号的改变，可实现对铅离子含量的检测。

2 试剂与仪器

2.1 仪器

PB-10pH计，电子分析天平，Hitachi F-7000荧光分光光度计。

2.2 试剂

凝血酶适体(5′-GGT TGG TGT GGT TGG-3′，简称TBA)由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。三羟甲基氨基甲烷、醋酸、结晶紫(crystal violet，简称CV)、Pb(NO3)2、KNO3、AgNO3、Cd(NO3)2、Ca(NO3)2、Mg(NO3)2、Zn(NO3)2、Al(NO3)3、Fe(NO3)3、NaF、乙腈(CH3CN)、抗坏血酸(Vc)、三乙醇胺(TEA)、乙二胺(EDA)都为分析纯。配制浓度为1mmol/L的结晶紫溶液，10mmol/L Tris-acetate缓冲溶液(pH分别为6.0,6.5,7.0,7.5,8.0)，溶剂均为超纯水。用10mmol/L Tris-acetate(pH 7.0)缓冲溶液配制凝血酶适体的储备液，浓度为25μmol/L。

3 实验方法

将一定量10μmol/L的结晶紫溶液加入微量荧光比色皿中，检测其荧光信号。将10μmol/L结晶紫与5μmol/L凝血酶适体混合，作用半小时，取一定量加入到微量荧光比色皿中，检测荧光信号。然后加入不同浓度的Pb2+，每次加量为1μL，使其最终浓度分别为50nmol/L、100nmol/L、500nmol/L、1μmol/L、5μmol/L，混合均匀，进行光谱扫描，观察荧光光谱的变化。激发波长Ex=590nm，扫描范围610～750nm，激发狭缝和发射狭缝均为10nm，光电倍增管电压为950V。

4 结果与讨论

4.1 凝血酶适体与结晶紫浓度比的选择

4.2 作用时间的考察

将10μmol/L结晶紫与5μmol/L凝血酶适体混合，每隔5分钟检测一次荧光强度。作用半小时后,加入5μmol/L Pb2+并混合均匀，再每隔5分钟检测一次荧光强度，以考察凝血酶适体与结晶紫作用时间及Pb2+的响应时间。实验结果显示在反应初期，随着时间的增加，荧光强度逐渐增大，说明与结晶紫结合的凝血酶适体的量逐渐增加。反应30分钟后，体系的荧光强度趋于稳定，所以在检测前需先将凝血酶适体与结晶紫培育30min，然后再加入Pb2+。结果表明，加入Pb2+后，体系的荧光强度将发生变化；至加入Pb2+10 分钟后，体系的荧光强度基本不再改变。故确定铅的作用时间为10分钟。

4.3 pH的选择

在10mmol/L Tris-acetate，pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0缓冲溶液中检测5μmol/L Pb2+和5μmol/L凝血酶适体、10μmol/L结晶紫的荧光强度，选出凝血酶适体与结晶紫作用的最佳pH。实验结果表明，当pH为7.0时，体系的荧光强度的变化最明显，因此，我们选择pH为7.0的10mmol/L Tris-acetate缓冲溶液为反应介质。

4.4 工作曲线及线性范围

在Pb2+浓度为1nmol/L～10μmol/L范围内，lg[Pb2+]与荧光强度的变化(F0-F)/F0呈线性关系，线性方程为y=0.99+0.11x，线性相关系数R=0.992；信噪比为3时，检测限为5×10-10mol/L。此方法的线性范围较宽，检测限低，基本上能够满足对于食品或环境中铅和汞污染的监测。

4.5 干扰离子的考察

由于多种离子都会诱导凝血酶适体与结晶紫发生构型改变，为了准确检验铅离子，希望该方法只对Pb2+响应，这就需要使用掩蔽剂来掩蔽其他离子对实验的干扰。我们在实验中使用了4种掩蔽剂(38μmol/L乙腈，1.72mmol/L抗坏血酸，20μmol/L三乙醇胺，1.72mmol/L氟化钠)，在最佳实验条件下，进行了选择性实验，取Na+和K+浓度为20μmol/L，其他金属离子浓度均为5μmol/L。结果表明，这4种掩蔽剂基本上不影响Pb2+反应。当选择20μmol/L三乙醇胺和1.72mmol/L抗坏血酸作掩蔽剂时，可以将其他金属离子的干扰降到最小。即在合适掩蔽剂存在的条件下，该方法对Pb2+具有较好的选择性。

4.6 实际样品的测定

采用我们设计的方法测定了自来水和湖水样品中的Pb2+。对于自来水，要打开水管放水20min后收集，煮沸5min以去除氯。湖水用0.2μm过滤膜过滤掉杂质，再煮沸5min以去除氯。通过实验，我们发现该方法与标准方法无显著性差异，结果令人比较满意(表1)。

表1 两种测Pb2+方法比较

表中数据为5次测定结果的平均值±标准偏差。

以上结果表明，我们建立的方法简单易行，在适当的掩蔽剂下选择性好、灵敏度高、检测限低、成本低廉、操作简便。传统的铅离子检测方法有原子吸收分光光度法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体原子发射光谱法、示波极谱法等，这些方法具有设备昂贵、耗时、方法繁琐等缺点，有的甚至使用了剧毒试剂，对实验人员危害比较大。因此，发展测试方法简单、操作简便、现象直观、成本低廉、试剂无毒或低毒的测定方法很有意义。

5 教学效果讨论

本文介绍了一个能体现学科交叉研究特点的研究型实验。学生在完成实验过程中，不仅要应用化学分析和仪器分析的理论知识，而且还能学习到核酸的基本性质及样品处理技术。学生在大量查阅文献的基础上，在教师的指导下，运用自己所学的理论知识，完成了实验方案的设计。在实验完成过程中，对实验细节的把握、异常问题的解决、数据的分析整理，都有助于锻炼学生的实践能力，经历理论付诸实践的过程；同时，学生也能从中体会到主动获得新知的乐趣，激发进行科学研究的兴趣和信心。此实验在陕西师范大学已开设两年，教学效果良好。

参 考 文 献

[1] Foster W G,McMahon A,Rice D C.ToxicolIndHealth,1996,12:723

[2] Loghman-Adman M.HealthPerspect,1997,105:928

[3] Ronis M J,Badger T M,Shema S T,etal.ToxicolEnvironHealth,1998,53:327

[4] He L,Poblenz A T.JBiolChem,2000,275:12175