儿童反复呼吸道感染与维生素D水平及受体基因单核苷酸多态性相关性研究

李仕勇 范美兰 冯文科

呼吸道感染是儿科常见疾病，其在临床发生率较高，对患儿和家属带来较大的不利影响［1，2］。随着医学研究水平的不断深入，对于基因多态性的研究也在不断深入。儿童反复呼吸道感染是否与维生素D水平及受体基因单核苷酸多态性有一定的相关性逐渐引起临床的广泛重视。笔者通过对广东省阳春市妇幼保健院儿童反复呼吸道感染病例临床资料进行观察和分析如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取本院2012年2月至2013年2月儿科收治的反复呼吸道感染患儿50例作为观察组，其中男27例，女23例，年龄8～13岁，平均年龄(10.3±2.3)岁，50例病例均有不同程度的反复呼吸道感染临床症状。同时选取同期本院健康体检100例作为对照组，其中男64例，女36例，年龄7～14岁，平均年龄(10.8±2.8)岁。两组研究对象的一般资料差异无统计学意义。

1.2 试剂与方法

1.2.1 抽取研究对象空腹外周血，采用ELISA法测定25-羟维生素D(25-OH-Vit D)水平，比较反复呼吸道感染患儿与健康儿童的25-羟维生素D(25-OH-Vit D)水平，分析反复呼吸道感染与不同25-羟维生素D(25-OH-Vit D)水平的关系。

1.2.2 试剂 上海复生生物有限公司生产的Taq DNA聚合酶、dNTPs、Markers，蛋白酶 K、Fok I、Bsm I、Apa I三个位点限制性内切酶。

1.2.3 DNA的提取为儿童反复呼吸道感染病例和对照组外周静脉血液3.0 ml，通过酚-氯法对DNA提取，保存于-20℃冰箱。参照文献设计引物的合成［3］，Bsm I上游引物为5，-AACCAAGACTACAAGTACCGGGTCAGTGA-3，下游引物为5，-TGGCGGCAGCGGATGTACGTCTGC-3，．Fok I上游引物5，AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT-3，下游引物 5，ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC3，Apa I上游引物 5，CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3，下 游 引 物 5，TGGCGGCAGCGGATGTACGTCTGC-3，

1.2.4 方法 通过PCR-RFLP技术对维生素D受体基因多态性进行分析，PCR反应体系为50 μl，循环参数为94℃进行预变性 10 min，94℃变性 1 min，65℃进行退火 1 min，72℃延伸90 s，循环35次，72℃延伸7 min，对产物进行琼脂糖电泳。

1.2.5 结果判定 Bsm I多态性判定，对PCR产物酶切后只有825bp一个条带，提示扩增的片段无Bsm I酶切位点，通过BB表示，如果显示为825bp、650bp、175bp三个条带说明有一个染色体上无酶切位点，另一个染色体上有酶切位点通过Bp表示，如果显示650bp和175bp条带，提示两个染色体上均有Bsm I酶切位点，通过bb表示。Fok I多态性判定，对PCR产物酶切后只有265bp一个条带，说明扩增的DNA片段无FokI酶切位点，通过FF表示，如果显示265bp、196bp、69bp三个条带提示扩增片段为杂合子，通过Ff表示，如果显示196bp、69bp两个条带，提示为两个染色体上均存在FokI酶切位点为纯合子，通过ff表示。Apa I多态性判定，对PCR产物酶切后只是显示740bp一个条带为无ApaI酶切位点的纯合子，通过AA表示，出现740bp、520bp、220bp三个条带为只有一个染色体上出现酶切位点的杂合子为Aa表示，520bp、220bp两个条带为均有酶切位点的纯合子通过aa表示。

1.2.5 两组研究对象均通过Hardy-Weinberg遗传平衡试验，通过基因型分布检验均符合Hardy-Weinberg遗传平衡。

1.3 观察指标

1.3.1 观察两组研究对象25-羟维生素D(25-OH-Vit D)水平情况。

1.3.2 观察两组研究对象维生素D受体基因型和基因频率分布情况。

1.4 统计学方法 采用统计学软件SPSS 15.0建立数据库，计数资料通过卡方检验分析，P＜0.05，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组研究对象25-羟维生素D(25-OH-Vit D)水平情况(如表1)反复出现呼吸道感染患儿的观察组的25-羟维生素D(25-OH-Vit D)水平明显低于对照组，P＜0.05，差异有统计学意义。

表1 两组研究对象25-羟维生素D(25-OH-Vit D)水平情况

2.2 两组研究对象维生素D受体基因型和基因频率分布情况(如表2、3、4)反复呼吸道感染患儿的观察组BsmI基因型Bb、bb频率明显高于对照组，P＜0.05，差异有统计学意义。

表2 两组研究对象维生素D受体Bsm I 基因频率分布情况

表3 表3两组研究对象维生素D受体Fok I基因频率分布情况(%)

表4 两组研究对象维生素D受体Apa I基因频率分布情况［n(%)，%］

3 讨论

反复呼吸道感染是儿科常见性疾病和多发性疾病，其约占呼吸道感染总发生率的30%，对儿童身心造成严重的影响，因其反复复发机制探讨不是十分清楚［4，5］。近年来随着分子生物学的不断发展，对于反复呼吸道感染患儿基因探讨也逐渐增多，尤其是对于维生素D作用的不断深入［6，7］。维生素D受体属于具有生物效应的核内生物大分子，是类固醇激素/甲状腺素受体超家族的成员之一，其在结构基因的表达具有很好的调节作用，其在维持机体钙磷代谢、细胞增殖分化具有重要的作用。本研究结果发现，反复出现呼吸道感染患儿的观察组的25-羟维生素D(25-OH-Vit D)水平明显低于对照组，提示25-羟维生素D水平降低可能和儿童反复呼吸道感染有着一定的相关性。随着对于反复呼吸道感染患儿维生素D受体水平探讨和基因多态性的探讨也逐渐增多［8］。维生素D不仅对机体钙代谢、磷代谢有较好的作用以外，其对于机体细胞增长、分化及免疫功能调节也有重要的作用。维生素D受体属于亲核蛋白，属于类固醇激素/甲状腺受体超家族的成员，受体和1，25-(OH)2D3结合后，其结合靶基因上游启动子或者是调控区域的DNA序列，再靶细胞胞核作用，进而出现一系列的生物效应。基因单核苷酸多态性主要是指一个生物群体同时存在两种或者多种不连续变异型或者基因型或者等位基因，期属于基因单核苷酸上的一种变异，多发生于基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域。基因单核苷酸多态性往往具有双重的意义，其一基因单核苷酸多态性可能是有害性的突变，逐步演变为可遗传的病因，另外一方面基因单核苷酸多态性作为较好的遗传标记，其再遗传病的研究中发挥较为重要的作用。维生素D受体基因多态性位点主要有四个，为限制性内切酶 Apal、BsmI、TaqI、FokI酶切位点。有资料显示，维生素D受体属于核内受体，期编码基因定位于12q13，其主要有8个内含子和9个外显子组成，其存在多个限制性内切酶位点，其多用 b、a、t、f表示多态性位点，同时用 B、A、T、F 表示缺乏4中内切酶的多态性位点。其中BsmI主要是通过调节mRNA稳定性和数目，进而影响蛋白质功能的，其可以影响增强子对于靶器官部位的亲和力和影响维生素D的亲和力。本研究分别对两组研究对象的Apal、BsmI、FokI三个酶切位点进行酶切，观察两组研究对象在三个位点的基因多态性情况。结果表明，两组研究对象在FokI两个酶切位点的基因型分布上无明显差异，但是两组在BsmI基因型分布上有明显的差异性，反复呼吸道感染患儿的观察组BsmI基因型Bb、bb频率和Apal基因型aa频率明显高于对照组，提示维生素D受体BsmI和Apal基因多态性可能是诱导呼吸道感染反复发生的重要诱因，或者可以说携带有Bb、bb及aa基因型可能成为儿童呼吸道反复感染的易感因素。综上所述，临床上应加强对于呼吸道反复感染患儿BsmI和Apal基因型的筛查，为指导临床用药提供理论依据，进而提高临床治疗疗效。

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［3］ AndrewRB，Donald PM，MarkH，eta．l Cloning and expression of full-length cDNA encodinghuman D receptor．ProcNatlAcadSc，i 1988，85：3294.

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［5］ 曾俐敏，栗平，内蒙古自治区蒙族和汉族维生素D受体基因多态性与骨质疏松相关性分析．慢性病学杂志，2010，12(1)：21-22.

［6］ 郑敏，罗建明，广西地区儿童维生素D受体基因BsmI和Tru9I酶切位点多态性分布．实用儿科临床杂志，2010，25(10)：513-515.

［7］ 李生强，葛继荣，谢丽华，等，福州地区汉族妇女绝经后维生素D受体基因BsmⅠ多态性与骨密度的关系．福建医科大学学报，2008，42(3)：250-252.

［8］ 王振华，李丽红，鲁继荣，等，维生素D受体基因多态性与小儿反复呼吸道感染的相关性研究．中国实用儿科杂志，2008，23(4)：304-305.