原位末端标记法检测齐墩果酸诱导细胞凋亡的实验研究

董静，李明珠，毕克滨，吴勃岩

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

全球每年患恶性肿瘤的人数达到1 200多万，据此估计至2020年全球肿瘤的发病率将上升50%。癌症已成为威胁人类健康的第一致死疾病。近年来中药有效成分在抗肿瘤方面的研究，主要是从中药有效成分诱导细胞凋亡的抗肿瘤机制入手。齐墩果酸(oleanlic acid，OA)，又名庆四素，属五环三萜类化合物，是广泛存在于自然界中的天然有效成分，在许多植物中含量丰富，如女贞子、山楂、白花蛇舌草、大枣、丁香等［1］。药理研究证实，齐墩果酸具有护肝解毒、降脂降糖、抗炎抑菌、抗病毒、抗氧化的作用，还具有提高机体免疫功能的作用［2］。本实验采用原位末端标记的方法，研究齐墩果酸对荷瘤小鼠肿瘤组织中细胞凋亡的影响，通过对凋亡指数的分析，探讨齐墩果酸诱导肿瘤细胞凋亡的作用。

1 实验材料

1.1 实验动物

昆明种小鼠，体质量18～22g，雌雄各半，购自黑龙江中医药大学实验动物中心。

1.2 瘤株、药物和试剂

小鼠S180腹水瘤株(哈尔滨医科大学附属肿瘤医院);齐墩果酸(珠海润都制药有限公司);环磷酰胺(CTX，上海华联制药有限公司);TUNEL试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

2 实验方法

2.1 S180肉瘤肿瘤模型的建立

取18～22g昆明种小鼠50只，将S180瘤株用生理盐水1∶3稀释，以0.2ml每只接种于小鼠右前腋下，制备小鼠实体瘤模型。

2.2 TUNEL 法检测

取接种S180瘤株的小鼠随机分为生理盐水(模型)组，环磷酰胺(CTX)组，齐墩果酸高、中、低剂量组。于接种S180肿瘤细胞6h后首次给药，齐墩果酸高、中、低剂量组分别按 4.992mg/kg、2.496mg/kg 和 1.248mg/kg灌服给药，每日1次。CTX组按40mg/kg腹腔注射给药，每日1次。模型组用生理盐水以0.2ml/只灌服，每日1次。连续给药8天后处死小鼠，剥离肿瘤组织，用福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，经HE染色后进行原位末端标记实验。采用原位细胞凋亡检测试剂盒，按说明书操作。经TUNEL试剂盒染色，细胞核内出现棕黄色的为凋亡细胞(阳性细胞)，计算凋亡指数(apoptosis index，AI)，即每张TUNEL切片选取5个阳性细胞数最多的高倍镜视野，每个视野计算100个肿瘤细胞，计算阳性细胞数与总细胞数的百分比［3］。

2.3 统计学处理

3 结果

齐墩果酸对S180荷瘤小鼠肿瘤组织细胞凋亡的影响，经原位末端标记法(TUNEL法)凋亡染色，细胞核呈现出棕黄色或者棕褐色染色的细胞为阳性细胞，细胞核蓝染的细胞是苏木素复染的阴性细胞。在10×40高倍镜下，选取5个阳性细胞数最多的高倍镜视野，每个视野计算100个肿瘤细胞精确选取其中的阳性细胞，对S180荷瘤小鼠肿瘤组织中各组细胞凋亡指数进行分析。结果见表1，与生理盐水(模型)组比较，齐墩果酸高、中、低组细胞凋亡指数明显上升(P＜0.01)，差异显著，具有统计学意义。

表1 齐墩果酸对S180荷瘤小鼠细胞凋亡的影响(±s)

表1 齐墩果酸对S180荷瘤小鼠细胞凋亡的影响(±s)

注:与模型组相比，＊＊P＜0.01。

组别 给药量(mg/ml) n 细胞凋亡指数(%)模型组 —10 4.3 ±1.494 43 CTX 组 40 10 15.4 ±1.505 55＊＊OA 高组 4.992 10 14.8 ±1.316 56＊＊OA 中组 2.496 10 14.4 ±1.074 97＊＊OA 低组 1.248 10 12.8 ±1.229 27＊＊

4 讨论

细胞凋亡是一种在形态学上区别于细胞坏死的程序性的死亡形式，在细胞接受特定的信号下，由凋亡相关基因控制的主动的细胞自我清除过程。从细胞凋亡角度分析，肿瘤形成是由于细胞增殖的数目大于细胞的死亡数目，使细胞总数不断地增加所致。所以，细胞的增殖和细胞凋亡的不平衡与肿瘤的形成和发展有关。细胞凋亡是治疗肿瘤的主要途径之一，凋亡细胞中的内源性核酸内切酶被激活后，DNA被切割成了许多双链DNA片段和高分子量单链DNA断裂点(缺口)，从而暴露出了大量的3－羟基末端。TUNEL法是标记的脱氧核苷酸(通常为dUTP)被末端转移酶TdT转移到DNA缺口或者3－羟基的末端上的一种方法。标记后的样品与相应的酶联抗体作用后可产生颜色反应，原位特异性的显示出凋亡细胞。主要采用的是荧光标记法与酶标记法，显微镜下观察［4］。本实验采用了TUNEL法观察细胞凋亡的情况，结合阳性的棕黄色细胞与HE染色，观察细胞凋亡的表现，从形态学上证实齐墩果酸具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。齐墩果酸对诱导肿瘤细胞凋亡的作用是多因素的复杂的生物学过程，诱导肿瘤细胞凋亡的具体机制还有待研究。本实验为临床上研究低毒、有效的抗癌药物奠定实验基础和提供科学数据。

［1］李旸，刘卓刚，吴斌.齐墩果酸抗肿瘤作用机制［J］.实用医学杂志，2010，26(20):3830 －3832.

［2］李欣，王艳宏，吕邵娃，等.齐墩果酸纳米脂质载体的制备及性质表征［J］.中医药学报，2013，41(1):59 －62.

［3］郑国灿.牛蒡子苷诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的实验研究［J］.中国病理生理杂志，2008，24(3):586 －587.

［4］何雯，张蓓，刘无逸.四种细胞凋亡检测方法的比较［J］.中外医疗，2007，27(24):1－2.