一株新高产黑色素海洋细菌DH166的鉴定和发酵条件研究

郭亦玲，王晓磊，李碧园，王凯迪，刘 敏，杜宗军*

（山东大学（威海），山东 威海 264209）

黑色素（melanin）是一种广泛存在于动植物和微生物中的非均质的类多酚聚合体，具有复杂结构，可呈现红色、褐色及黑色。微生物产生的黑色素主要分为壁（膜）结合黑色素和胞外黑色素。黑色素通常不溶于水、酸溶液和普通有机溶剂。研究表明，这种色素对于生物的生长、发育并非必不可少，但是却能提高生物的生存和竞争能力，可以为生物体抵抗紫外线和电离辐射、抗氧化、结合金属离子，减少其对生物体的伤害，具有广泛的开发应用潜力[1-2]。黑色素应用广泛，但是许多合成色素对人体有一定的危害性，有的甚至有致癌作用，于是天然色素因其使用安全性越来越收到青睐[3]。产黑色素细菌资源较丰富，便于操作，且细菌黑色素一般是由体内的酪氨酸酶催化酪氨酸，然后再经一系列氧化过程而形成，属于氨基酸的衍生物，具有无毒、无害、产品稳定性好的特点，因此研究微生物产生黑色素具有很大的优势，越来越得到广泛重视。本文对一株高产黑色素菌株DH166的分类以及产胞外黑色素特性进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

细菌DH166由本实验室分离自东海大陆架中部海域，50m深水层处。

1.2 培养基

2216 海洋细菌培养基：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸铁0.01g，琼脂15g，陈海水1000mL，pH 7.2～7.6。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨5g，陈海水1000mL，pH 7.4。

酪氨酸培养基：葡萄糖1g，蛋白胨5g，牛肉膏5g，CaCl20.1g，L-Tyr2g，陈海水1000mL，pH 7.0。

5#培养基[4]：葡萄糖1g，（NH4）2SO45g，L-Tyr2g，陈海水1000mL，pH 7.0。

1.3 菌种鉴定

1.3.1 革兰氏染色及形态观察

根据文献所述方法[7]，对DH166进行革兰氏染色，鞭毛染色，芽孢染色和运动性观察等。

1.3.2 生理生化鉴定

需盐性试验、生长温度试验、氧化发酵试验，过氧化氢酶、明胶酶、淀粉酶、柠檬酸盐利用等实验按照文献进行[8-9]。

1.3.3 16 S rDNA序列测定和分析[6]

将细菌接种在平板上，28℃培养过夜。取单一菌落悬浮于50μL无菌蒸馏水中，于100℃水浴加热5min，离心，取上清作为PCR模板DNA。

扩 增 16SrDNA 基 因 的 正 向 引 物 为 27F：5’-AGAGTTTGATC（C/A）TGGCTCAG-3’（对应于E.coil16S rDNA基因的第8～27个碱基位置），反向引物1492R：5’-TACGG（C/T）TACCTTGTTACGACTT-3’（对应于E.coli16S rDNA基因的第1492～1510个碱基位置）。在100μL的PCR反应体系中含有：1×PCR缓冲液，1.5mmol/L MgC12，4×dNTP混合物各200μmol/L，引物各0.5μmol/L，Taq DNA聚合酶1μL（5U/μL），2μL DNA 原液。PCR反应条件为96℃预变性6min；接94℃变性1min，50℃复性lmin，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃温育6min。PCR扩增产物经电泳检测后，直接交由上海生工生物工程技术公司进行纯化和序列测定。

将测定的基因序列输入Genbank，获得收录号。并运用Blast程序与数据库中已存在的细菌16S rDNA基因序列进行相似性比较分析。

1.4 黑色素的提取

黑色素的提取和初步纯化参照文献的方法[5]：将菌株接种于Tyr发酵培养基，28℃摇床培养72h，发酵液过滤离心后，用盐酸调节上清液pH值为2～3，静置过夜，12000r/min离心，将沉淀100℃烘干，即得到黑色素粗品。

1.5 黑色素的吸收光谱

取发酵液30mL 5000r/min离心15min，沉淀中加入丙酮5mL，混匀后，冰浴条件下超声裂解，补加丙酮15mL，5000r/min离心5min，上清液即为色素萃取液。以丙酮为空白组，使用8453E分光光度系统对色素萃取液进行全波段扫描，得到该色素的吸收峰。

2 结果与分析

2.1 培养特性

DH166在海水配制的牛肉膏蛋白胨培养基上生长良好，菌落呈黑色，表面光滑，直径2mm～3mm，由于细菌向培养基中分泌色素，菌落周围的培养基呈现黑色。在2216海洋细菌培养基上可以生长，但不如在牛肉膏蛋白胨培养基上生长旺盛。在酪氨酸培养基中，可以观察到细菌向周围的培养基中分泌大量的黑色色素，培养基中添加酪氨酸对于色素的产量具有明显的促进作用（见图1）。在5#培养基上生长非常微弱，初步分析是由于培养基营养成分不够丰富。

图1 细菌DH166在酪氨酸培养基中的生长情况Fig.1 Growth of DH166 on tyrosine medium

2.2 形态观察及生理生化鉴定

形态观察及生理生化鉴定的结果（见附表）。DH166为革兰氏阴性杆状菌，极生鞭毛，有运动性，未观察到芽孢产生。在对DH166进行培养的过程中发现，细菌DH166的生长需要丰富的营养条件。如果培养基中不添加蛋白胨和牛肉膏一类含各种有机物的营养成分，菌株的生长就非常微弱。①21℃培养生长缓慢，产黑色素的效果也不是很好。25℃生长快，产黑色素效果好，28℃生长快，但是产黑色素效果似乎不如25℃条件下好。②DH166生长要求条件比较高。在2216E培养基上可以生长，但总起来讲长得不是多好。在添加牛肉膏的培养基比2216E培养基中，细菌的生长状况更好。此外，细菌在固体培养基中的生长比液体培养基好。进行了细菌DH166唯一碳源利用的实验，在仅有无机盐构成的培养基中，分别添加了葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖等多种糖类，结果发现，在不添加营养丰富的有机物的情况下，DH166在这些培养基中都不能够生长。

附表 DH166的形态及生理生化特征Attached table Morphology,the physiological and biochemical characters of DH166

2.3 16S rDNA序列测定和分析

按上述方法进行序列扩增，扩增所得序列送往上海桑尼生物科技有限公司进行序列测定，得到核苷酸序列。16S rDNA序列提交至Genebank，获得收录号：DQ493656。DH 166在前述各种培养基上均有生长，菌落呈黑色，表面光滑。过氧化氢酶、明胶酶、卵磷脂酶、氧化酶、硝酸盐还原阳性，淀粉酶、柠檬酸利用、V.P反应、甲基红反应、H2S产生、葡萄糖产气、精氨酸双水解等阴性，O/F试验发酵产酸，综合16S rDNA序列分析结果，可初步确定该菌属于假交替单胞菌属。

2.4 黑色素的提取鉴定与吸收光谱

DH166液体培养物136mL，按文献方法得177mg黑色素粗提物，即130mg/100mL。

按上述方法获得DH166的吸收光谱（见图2），由图2可知，其最大吸收峰位于波长232nm处。此次分离出的DH 166产黑色素产量高，达130mg/100mL，即1.3g/L，并且大量向培养基内分泌，经酪氨酸诱导可显著提高其胞外黑色素的产量，而文献报道的最高产量为0.60g/L，且不具酪氨酸诱导的特点[4]。

图2 DH166的吸收光谱Fig.2 DH166 absorption spectrum

3 结论

从东海大陆架中部海域50m深水层处分离获得一株产黑色素的菌株DH166，通过菌体形态特征观察、生理生化鉴定和系统发育学分析，初步鉴定DH 166菌种属于假交替单胞菌属。

海洋具有高压、高盐、低营养、低温、无光照等独特的环境，这些特殊的环境使得海洋微生物的种类更加多样，代谢途径更加复杂，初级代谢产物和次生代谢产物种类也更为繁多、结构更加新颖，可能产生完全不同于陆地微生物的新型生物活性物质。目前有关海洋细菌生产黑色素的研究还很少，对于海洋细菌所产黑色素的性质是否与陆地细菌所黑色素相一致、黑色素对海洋细菌本身的生态学意义以及该黑色素是否具有其它生物活性还有待于进一步深入研究[13]。由于该菌种产黑色素快，产量高，约为1.3g/L，且大量向培养基内分泌，易于分离，因此DH 166菌种有望成为一类新的黑色素生产菌种。

[1]BELL AA,WHEELER MH.Biosynthesis and functions of fungal melanins[J].Ann Rev Phyt,1986,24:411-451.

[2]SARNA T,MENON IA,SEALY RC.Photoinduced oxygen consumption in melanin system-II.Action spectra and quantum yields for pheomelanins[J].Photochem Photobiol,1984,39:805-809.

[3]MEKKAWY HA,ALI MO,EL-ZAWAHRY AM.Toxic effect of synthetic and natural food dyes on renal and hepatic functions in rats[J].Toxicol Lett,1998,95:155.

[4]李建波，宋 欣，曲音波.产胞外黑色素菌株的筛选[J].微生物学通报，2004，31（1）：50-54.

[5]SAVA VM,YANG SM,HONG MY,et al.Isolation and characterization of melanic pigments derived from tea and polyphenols[J].Food Chem,2001,73:177-184.

[6]莫照兰，茅云翔，陈师勇，等.一株牙鲆出血症病原菌的分子生物学鉴定[J].高技术通讯，2001（12）：12-17.

[7]沈 萍，范秀容，李广武.微生物学实验[M].北京：高等教育出版社，1999.

[8]周德庆.微生物学实验手册[M].上海：上海科学技术出版社，1983.

[9]徐怀恕，杨学宋，李 筠.对虾苗期细菌病害的诊断和控制[M].北京：海洋出版社，1999.

[10]李建波，宋 欣，田 敏，等.粗糙脉孢菌产黑色素条件优化及黑色素物理特性研究[J].山东大学学报：理学版，2004，39（4）：120-124.

[11]SOLANO F,GARCIA E,DE EGEA EP,et al.Isolation and characterization of strain MMB-1(CECT 4803),a novel melanogenic marine bacterium[J].Appl Environ Microb,1997,63(9):3499-3506.

[12]欧剑虹，倪丽娜，黄永胜，等.一株黑色素高产细菌的发酵条件研究[J].中国医药工业杂志，2004，35（9）：528-530.

[13]朱 琳，商倩倩，游 偲，等.一株产黑色素海洋细菌的筛选、鉴定及发酵条件优化[J].海洋环境科学，2011 ，30（5）：686-688.