厄贝沙坦联合格列齐特对2型糖尿病大鼠肾功能的保护作用与机制

兰海涛，刘红，买文丽，刘行海，刘华，郑倩

（川北医学院生理学教研室，南充 637000）

随着肥胖人群的快速增长，2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者数量也不断增加。据全国糖尿病研究协作组报告［1］，我国糖尿病患病人数已经超过9 000万，潜在患者超过6 000万，成为世界第一糖尿病大国。在所有糖尿病患者中，90%以上都是T2DM［2］。糖尿病肾病对患者生存质量具有显著影响，也是糖尿病患者主要死亡原因之一［3］，探索糖尿病肾脏功能保护的治疗方案，具有重大的临床和社会价值。近年来研究［4，5］表明，肾素－血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）不仅存在于循环系统中，也存在于局部组织中，肾组织长期RAS活跃，可以引起肾脏微循环血管的损害，肾脏系膜细胞纤维化，最终导致肾脏组织结构重塑，造成肾脏功能严重受损。所以，本实验探索在传统降血糖药物格列齐特基础上，联合厄贝沙坦治疗糖尿病大鼠，观察其对模型大鼠肾脏功能的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

格列齐特片Ⅱ（天津华津制药厂）、厄贝沙坦（广州海瑞药业有限公司）、链脲佐菌素（STZ，Sigma公司），总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、血肌酐（Cr）、血尿素氮（BUN），钠泵检测试剂盒（南京建成生物公司）、血清胰岛素（FINS）检测试剂盒（上海市生物制药研究所），快速血糖测定仪及芯片（三诺SXT－1型，长沙）、无创尾动脉血压测量分析系统（北京众实迪创科技公司）。每100mL蒸馏水中溶入1.0g格列齐特Ⅱ和0.5g厄贝沙坦。

1.2 实验动物及饲料

雌性Wistar大鼠，2月龄，清洁级，体质量130～160g。普通饲料：6%脂肪、22%蛋白质、57%碳水化合物、7%纤维素和8%其他成分。高能饲料（62%常规饲料、20%蔗糖和18%猪油）。

1.3 动物模型建立与分组

参照实验室传统方法［6］建立糖尿病大鼠模型：80只实验大鼠，16只用于正常对照，64只用于复制T2DM模型。全部实验大鼠普通饲料适应性饲养1 w，造模大鼠高能饲料饲养4w后一次性腹腔注射STZ 25mg/kg（注射前30min用0.1mol/L枸橼酸液配成0.25%的终浓度）。高能饲料继续饲养4 w后采尾静脉血测定空腹血糖（FBG）、TC、TG、FINS，计算胰岛素敏感指数（insulin sensitivity index，ISI）＝-ln（FBG＊FINS）［7］。最后选取 FBG＞7.8mmol/L，同时伴有ISI降低的48只大鼠作为T2DM模型［8］，其余淘汰。将实验大鼠分成正常对照组（A1、A2）、模型对照组（B1、B2）、格列齐特治疗组（C1、C2）、厄贝沙坦联合格列齐特治疗组（D1、D2），每小组n＝8，分别用于8w和16w治疗及相应对照实验。治疗组每日给予格列齐特100mg/kg或者厄贝沙坦50mg/kg＋格列齐特100mg/kg［9，10］，一次性灌胃治疗。正常对照组与模型对照组每日给予等量的溶剂灌胃。在治疗期间，全部大鼠都用普通饲料喂养，自由饮水。实验动物分别于治疗后8w末和16w末（期间死亡2只动物）禁食不禁水12h，测尾动脉收缩压（SBP），30mg/kg戊巴比妥钠麻醉后从心脏采血提取血清用于生化检查、FINS检测，摘取双侧肾脏，去包膜后用滤纸吸干水分后称重，将双肾质量（g）与体质量（kg）之比（KW/BW）作为肾脏肥大指数。左侧肾脏-70℃冻存备用，用于肾皮质的分离和钠泵活性测定。

1.4 指标检测

严格按照试剂盒说明书，血糖仪测定血糖，751分光光度计测定TG、TC、Cr和BUN，放射免疫分析法测定FINS。提取肾皮质，按照钠泵活性检测试剂盒要求，测定钠泵活性。尾动脉测压法：把实验鼠放入40℃控温盒5min后，再放入37℃恒温大鼠固定器中，暴露出实验鼠的尾巴测量SBP，每个实验鼠加温的时间相同。每次测血压时连续记录5个血压读数，舍去最高和最低值，其他3个值的平均值作为此次的血压值。

1.5 统计学方法

所有数据均采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量结果均以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析和t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 厄贝沙坦联合格列齐特对T2DM大鼠一般情况的影响

造模结束时，模型大鼠出现明显的糖尿病“三多一少”症状，毛发紊乱，弓背蜷体，精神萎靡，反应迟钝，并且症状随病程逐渐加重。经格列齐特或厄贝沙坦联合格列齐特治疗8w后，上述症状体征明显好转，治疗16w后，情况更进一步好转。

2.2 厄贝沙坦联合格列齐特对T2DM大鼠血脂、血糖和SBP的影响

与同期正常对照组比较，糖尿病模型对照组大鼠8w和16w时，TC、TG、FBG和SBP均显著升高（P＜0.01）；格列齐特治疗组8w和16w时，TC、TG和SBP均显著升高（P＜0.01），FBG差异无统计学意义（P＞0.05）；厄贝沙坦联合格列齐特治疗8w和16w后，大鼠TC和TG仍显著升高（P＜0.01），但FBG和SBP差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型对照组比较，格列齐特治疗组8w和16w时，大鼠TC、TG和FBG水平显著降低（P＜0.01），SBP差异无统计学意义（P＞0.05）；厄贝沙坦联合格列齐特治疗8w和16w后，大鼠TC、TG、FBG和SBP水平显著降低（P＜0.01）。与格列齐特治疗组比较，联合治疗组SBP显著下降（P＜0.01），TC、TG和FBG差异无统计学意义（P＞0.05）。联合治疗组8w与16w大鼠比较，TC、TG、FBG和SBP差异无统计学意义（P＞0.05）（见表1）。

表1 厄贝沙坦联合格列齐特对T2DM大鼠血脂、血糖和SBP的影响（±s）

表1 厄贝沙坦联合格列齐特对T2DM大鼠血脂、血糖和SBP的影响（±s）

aP＜0.01，与同期A组比较；b P＜0.01，与同期B组比较；c P＜0.01，与同期C组比较

组别 n TG/mmol·L－1 TC/mmol·L－1 FBG/mmol·L－1 SBP/mmHg A18 0.82±0.24 1.96±0.35 4.82±0.47 125.15± 9.26 A2 8 0.94±0.26 2.12±0.41 5.56±0.59 126.42± 9.31 B1 8 2.61±0.46a 3.55±0.87a 16.28±2.33a 136.35±11.82a B2 6 2.23±0.40a 3.28±0.62a 15.25±2.16a 145.10±12.68a C1 8 1.48±0.32ab 2.83±0.44ab 5.21±0.47b 133.52±10.26a C2 8 1.26±0.25ab 2.56±0.33ab 5.40±0.49b 143.01±11.75a D1 8 1.54±0.35ab 2.66±0.45ab 5.06±0.54b 121.03±11.47bc D2 8 1.24±0.28ab 2.45±0.36ab 5.21±0.48b 120.24±10.45bc

2.3 厄贝沙坦联合格列齐特对T2DM大鼠FINS、ISI、Cr、BUN和KW/BW和肾皮质钠泵活性的影响

与同期正常对照组比较，模型对照组大鼠8w和16w时，FINS、Cr、BUN显著升高，肾皮质钠泵活性和ISI显著降低；模型对照组大鼠16w时，KW/BW也显著升高（P＜0.01）。与模型对照组比较，格列齐特治疗组8w和16w时，大鼠FINS、Cr和BUN显著降低，ISI和肾皮质钠泵活性显著降低升高（P＜0.01），16w时KW/BW也显著升高（P＜0.01）；厄贝沙坦联合格列齐特治疗8w和16w时，大鼠FINS、Cr和BUN显著降低，ISI和肾皮质钠泵活性显著升高（P＜0.01），16w时KW/BW也显著升高（P＜0.01）。与格列齐特治疗组比较，联合治疗组Cr和BUN显著降低，ISI和肾皮质钠泵活性显著升高（P＜0.01），16w时KW/BW也显著升高（P＜0.01）。联合治疗组8w与16w大鼠比较，16 w时BUN显著降低（P＜0.01），其余指标差异无统计学意义（P＞0.05）（见表2）。

表2 厄贝沙坦联合格列齐特治疗对T2DM大鼠FINS、ISI、Cr、BUN、KW/BW和肾皮质钠泵活性的影响（±s）

表2 厄贝沙坦联合格列齐特治疗对T2DM大鼠FINS、ISI、Cr、BUN、KW/BW和肾皮质钠泵活性的影响（±s）

aP＜0.01，与同期A组比较；b P＜0.01，与同期B组比较；c P＜0.01，与同期C组比较；d P＜0.01，与D1组比较

组别 n FINS/mIU·L ISI Cr/μmol·L－1 BUN/mmol·L－1 KW/BW 钠泵活性/pmol·mm－1·h－1 A1 8 16.43±3.55 -4.15±0.33 60.22±6.21 5.68±0.49 6.06±0.24 1746±122 A2 8 17.68±4.72 -4.38±0.34 63.15±6.48 5.87±0.54 6.04±0.25 1783±135 B1 8 22.24±5.86a -5.18±0.46a 72.17±7.44a21.51±4.83a 6.21±0.38 1575±196a B2 6 24.37±5.66a -6.14±0.55a 86.39±9.72a32.11±5.82a 8.63±0.45a 1281±112a C1 8 19.42±5.58b -4.71±0.29b 69.22±6.34b 18.41±3.87ab 6.15±0.26 1630±129b C2 8 19.87±5.31b -4.46±0.37b 77.86±7.19b 13.73±2.05ab 7.83±0.41b 1451±116b D1 8 17.39±5.48b -4.28±0.31bc 62.91±6.55bc 15.36±3.79abc 6.12±0.30 1801±140b D2 8 17.27±5.13b -4.06±0.32bc 65.38±7.06bc 9.45±1.28abcd 7.35±0.44bc 1776±127bc

3 讨论

实验复制的T2DM大鼠具有中度高血糖、高血脂，FINS不低但ISI显著下降的特点，同时还具有多饮、多食、多尿和精神活动下降的症状，这与人类T2DM的症状和体征十分类似。T2DM模型大鼠经过厄贝沙坦联合格列齐特治疗8w和16w后，血糖血脂、Cr、BUN和FINS显著降低，ISI和肾皮质钠泵活性显著升高，糖尿病“三多一少”的症状也得到不同程度改善，表明厄贝沙坦联合格列齐特对T2DM模型大鼠具有显著的治疗作用。

格列齐特主要作用于胰岛B细胞，可恢复胰岛素生理性分泌模式，提高血中胰岛素水平，同时抑制肝糖原分解，并促进肌肉组织利用葡萄糖，从而降低血糖［11］。

有研究［12］证实，格列齐特可升高血清脂联素，降低白介素-6、肿瘤坏死因子，从而减轻血管的炎症破坏，改善内皮细胞和微循环功能。

研究［13］表明，在高糖状态下，肾脏局部RAS异常活跃。厄贝沙坦为血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）受体抑制剂，通过选择性地阻断AngⅡ与AT1受体的结合，抑制血管收缩和醛固酮的释放，产生降压作用。近年来研究［14］发现，RAS不仅存在于循环系统中，也存在于局部组织中，机体几乎所有组织器官，如心脏、血管、脑、肾脏、肺脏、肝脏、肾上腺、卵巢、睾丸和脂肪等组织都已证实存在RAS，其在局部组织中的作用甚至超过循环系统中的RAS。长期血管紧张素生成增高，不仅会导致血压升高，还能引起组织结构重塑，造成心、脑、肾、眼等器官的损害。对循环系统中RAS正常的高血压患者，抑制血管紧张素作用的药物也能显著降低患者的血压。如果肾脏组织局部RAS过高，可以引起肾脏微循环血管的损害，肾脏系膜细胞纤维化，最终导致肾脏组织结构重塑，造成肾脏功能严重受损［15］。厄贝沙坦可以选择性阻断AngⅡ与AT1受体结合，降低皮质转化生长因子β1及其Ⅱ型受体mRNA的表达，抑制细胞外基质积聚，减轻肾脏肥大，延缓糖尿病肾病的发展［16，17］。

糖尿病患者肾皮质钠泵活性的变化早于肾脏形态和结构的改变，这种改变可能加重小管与间质细胞的功能和病理损害［18］。研究［19］表明，长期的高血糖，能够激活肾皮质细胞内的蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），而PKC能使钠泵磷酸化而降低活性。实验第8周末，肾皮质钠泵活性显著降低，同时Cr和BUN升高，表明肾小管和集合管物质转运功能已经受损，但此时还未发生器质性改变，肾脏未见肥大。16w时，肾皮质钠泵活性进一步降低，Cr和BUN进一步升高，肾脏已经显著肥大，表明肾脏已经由功能损害转为形态改变。不管是格列齐特单独治疗还是厄贝沙坦联合格列齐特治疗8w和16w后，肾皮质钠泵活性降低的效应被显著抑制，Cr和BUN也明显下降，但是实验结果提示联合用药组效果明显优于格列齐特单独治疗组，其原因可能与厄贝沙坦联合格列齐特治疗后，糖尿病大鼠血糖血脂水平下降，对肾皮质细胞膜上钠泵的磷酸化作用减弱导致钠泵活性升高，同时厄贝沙坦抑制了肾脏局部和血液中RAS的活性相关。

综上所述，厄贝沙坦联合格列齐特对T2DM大鼠肾脏功能具有一定的保护作用，而且其作用优于格列齐特单独治疗，其机制可能与联合用药可降低糖尿病大鼠血糖水平，减弱PKC对钠泵的磷酸化，从而稳定肾皮质钠泵活性的同时，厄贝沙坦抑制肾脏局部和血液中RAS的活性有关。

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