新疆维吾尔族乳腺癌中细胞色素P450 19基因rs10046位点基因多态性与病理免疫组化指标表达状态的研究

杨亮，李涌涛，齐新，艾司克尔·阿尤甫，徐立坤，朱丽萍

（新疆医科大学附属肿瘤医院乳腺外科，乌鲁木齐 830011）

1 资料与方法

1.1 临床资料

搜集2010年10月～2012年7月就诊于新疆医科大学附属肿瘤医院的112例维吾尔族初诊原发性乳腺癌患者（病例组）和体检正常的139例维吾尔族健康女性（对照组）。病例组年龄22～71岁，平均（44.45±9.22）岁；对照组年龄25～68岁，平均（45.30±9.60）岁。收集病例组及对照组患者的一般资料、术后病理资料，回顾性分析既往初潮时间、月经史、恶性肿瘤家族史、生育史、哺乳史等与乳腺癌相关的危险因素。

1.2 纳入研究的筛选

1.2.1 病例组纳入标准 1）组织学诊断原发维吾尔族女性乳腺癌病例；2）入院前无内分泌、放疗及化疗治疗史；3）无其他系统恶性肿瘤病史，排除乳腺癌转移、有精神疾患或乳癌晚期患者；4）患者知情同意并签署知情同意书；5）经过医院伦理委员会批准。

1.2.2 病例组排除标准 1）入院前接受激素治疗；2）合并严重的心、肺、肝、肾等脏器功能障碍；（3）在新疆地区居住未满10年。

1.2.3 对照组纳入标准 1）体检健康维吾尔族女性；2）与病例组匹配年龄±5岁；3）经过医院伦理委员会批准，患者知情同意后采集外周血并签署知情同意书。

1.2.4 对照组排除标准 1）接受过激素治疗；2）既往患有心、肺、肝、肾等脏器病变；3）在新疆地区居住未满10年；4）怀孕、哺乳期妇女。

1.3 实验室检测

1.3.1 材料和试剂 全血基因提取系统购自天根生化科技（北京）有限公司，引物使用上海生工公司提供引物，限制性内切酶（Bsp1286Ⅰ）（10U/μL）为加拿大（Fermentas MBIFermentas）公司提供。

1.3.2 方法 采用含有乙二胺四乙酸二钠（EDTA）抗凝管抽取病理组与对照组清晨空腹外周静脉血2mL，编号标记。取全血500μL加入1 000 μL红细胞裂解液裂解红细胞，提取DNA，使用紫外分光光度仪测量DNA浓度及OD值。提取DNA置于-20℃冰箱中保存备用。应用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）基因分型法进行CYP19rs10046位点多态性检测，此位点位于3＇非翻译区，C→T多态位点。根据参考文献及GenBank中CYP19基因序列用Primer3.0软件设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成：上 游 引 物 （Forward）：5＇-CTGGAACACTAGA GAAGGCTGGTCAGTGC-3＇；下游引物（Reverse）：5＇-GTTCTCTGGTGTGAACAGGAGATGAC-3＇，扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，40次循环后72℃最终延伸5min。PCR扩增产物经过2%琼脂糖凝胶110V恒定电压下电泳30min分离，Marker所示条带由上至下分别为 500bp、400bp、300bp、200bp、150bp、100bp、50bp共7条条带，当PCR产物在202bp处出现特异性荧光带，表示扩增成功。将扩增产物及SduⅠ（Bsp1286Ⅰ）内切酶取出并置于冰盒内，按反应体系配好分装至0.2mL PCR管内，加入扩增产物，于37℃恒温水浴锅内消化过夜12h后取出，低速离心提取酶切反应产物在80V恒定电压下电泳80min，电泳位置上有特异性扩增带的表明相酶切成功。未被酶切开的长度202bp的一条亮带为TT型，出现172bp和30bp 2个条带的为CC型，出现202bp、172bp、30bp 3个条带的为TC型。随机对选取的部分CYP19基因3种基因型PCR扩增产物进行基因序列测定。

1.3.3 免疫组化指标评价标准 ER、PR染色定位于细胞核。高倍镜下综合染色强度和阳性细胞所占比例，用组织学评分（∑pi）计算积分。其中i代表细胞染色深浅，包括0：不显色或显色不清；1：浅黄色；2：棕黄色；3：深褐色。P代表将阳性细胞的百分率数值进行半定量分级：不着色为阴性（-）；＜5%为0分：5%～50%为2分；50%～75%为3分；≥75%为4分。积分1～3分为弱阳性（＋），3～8分为中度阳性（＋＋），9～12分为强阳性（＋＋＋）。

C-erbB-2阳性细胞为膜着色，不着色为阴性（-）；着色阳性细胞数＞10%为阳性，其中着色弱且不连续为弱阳性（＋），着色中等部分不连续为阳性（＋＋），着色强且连续为强阳性（＋＋＋）。

Ki-67阳性细胞多数为核着色，呈棕黄色，少数为较弱的细胞质染色；根据切片所选视野中阳性细胞占全部细胞的比例将其分为：阳性细胞数＜10%为阴性（-）；10%～25%为弱阳性（＋）；26%～50%为阳性（＋＋）；＞50%为强阳性（＋＋＋）。

1.4 统计学方法

全部资料用SPSS18.0统计软件分析操作，各基因型结果进行 Hardy-Weinberg（H-W）平衡法则检验，采用χ2进行组间基因型与等位基因型频率及免疫组化相关性的比较。检验水准α＝0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因组DNA检测结果

紫外分光光度法检测样本基因组DNA：251个样本的平均浓度为566.20ng/μL，平均 OD值1.82。

2.2 CYP19基因PCR扩增产物电泳图

CYP19基因rs10046片段经引物所扩增后，其产物为202bp，在Marker标记位于第3条300bp和第4条200bp之间并接近200bp有特异性大小的片段产生，保存图像并记录（见图1）。如有未显现的样本则记录编号，分析阴性原因后重复PCR过程，必要时重新提取基因组DNA。

2.3 CYP19基因rs10046位点扩增片段SduⅠ（Bsp1286Ⅰ）酶切结果

未被酶切开的长度202bp的1条亮带为TT型，出现172bp和30bp 2个条带的为CC型，出现202 bp、172bp、30bp 3个条带的为TC型（见图2）。

图1 CYP19基因PCR扩增产物电泳图

图2 CYP19基因扩增产物SduⅠ（Bsp1286Ⅰ）酶切电泳图

2.4 PCR产物测序鉴定

随机选取的CYP19rs10046位点3种基因型PCR扩增产物进行基因序列的测定结果显示如图，测序结果中碱基的改变与酶切结果一致（见图3）。

2.5 免疫组化指标的表达

2.5.1 ER、PR蛋白在乳腺癌组织中表达

2.5.2 Ki-67、Her-2蛋白在乳腺癌组织中表达

2.6 Hardy-Weinberg平衡检测

SPSS18.0统计软件进行 Hardy-Weinberg平衡的分析，病例组（χ2＝2.646，P＞0.05），对照组（χ2＝2.092，P＞0.05），病例组和对照组的基因型均符合 Hardy-Weinberg平衡定律（见表1、2）。

2.7 基因型分布

年龄22～71岁，平均年龄为（44.45±9.22）岁，病例组112例中CC型30例，TC型48例，TT例34例，分别为26.8%，42.9%，30.4%；对照组139例中CC型25例，TC型82例，TT型32例，分别为18.0%，59.0%，23.0%，两组比较差异有统计学意义（χ2＝6.991，P＜0.05），CYP19基因C、T等位基因型频率病例组为48.2%、51.8%，对照组为47.5%、52.5%，差异无统计学意义（χ2＝0.027，P＞0.05）（见表3）。

表1 病例组Hardy-Weinberg平衡检测

表2 对照组Hardy-Weinberg平衡检测

2.8 乳腺癌组织中免疫组化指标与基因多态性的关系

112例标本临床资料中有92例免疫组化结果登记完整且由2位副高以上职称病理科医师判读结果一致，ER表达阴性的为36例，弱阳11例，中阳13例，强阳32例。PR表达阴性的为40例，弱阳11例，中阳15例，强阳26例。Her-2表达阴性的为27例，弱阳24例，中阳28例，强阳13例。Ki-67结果登记完整的病例为83例，表达阴性的为10例，弱阳13例，中阳12例，强阳48例。

2.8.1 ER表达与CYP19基因多态性 病例组中ER表达在CYP19基因的rs10046位点CC型、TC型、TT型及C、T等位基因中差异无统计学意义（χ2＝5.420，P＞0.05）；在病例组中CYP19基因的CC型、TC型、TT型及C、T等位基因与ER表达没有相关性（P＞0.05）（见表4）。

2.8.2 PR表达与CYP19基因多态性 乳腺癌组织中PR的表达在CYP19基因的rs10046位点基因的CC型、TC型、TT型及C、T等位基因中差异无统计学意义（χ2＝5.7，P＞0.05）；在病例组中CYP19基因的rs10046位点的CC型、TC型、TT型及C、T等位基因与PR表达没有相关性（P＞0.05）（见表5）。

表3 基因型及等位基因在病例组及对照组的分布

表4 基因型分布与ER在病例组的表达

表5 PR表达与CYP19基因多态性

2.8.3 Her-2 表达与 CYP19基因多态性 Her-2表达在病例组中CYP19基因的rs10046位点的CC型、TC型、TT型及C、T等位基因中差异无统计学意义（χ2＝4.276，P＞0.05）；在病例组中CYP19基因rs10046位点的CC型、TC型、TT型及C、T等位基因与 Her-2表达没有相关性（P＞0.05）（见表6）。

表6 Her-2表达与CYP19基因多态性

图3 CYP19基因片段PCR扩增后产物测序结果

图4 ER蛋白在乳腺癌组织中的表达（×100倍） 图5 PR蛋白在乳腺癌组织中的表达（×100倍） 图6 Ki-67蛋白在乳腺癌组织中的表达（×100倍） 图7 Her-2蛋白在乳腺癌组织中的表达（×100倍）

2.8.4 Ki-67表达与CYP19基因多态性 病例组 中Ki-67表达在CYP19基因rs10046位点的CC型、TC型、TT型及C、T等位基因中差异无统计学意义（χ2＝2.685，P＞0.05）；在病例组中 CYP19基因rs10046位点的CC型、TC型、TT型及C、T等位基因与Ki-67表达没有相关性（P＞0.05）（见表7）。

表7 Ki-67表达与CYP19基因多态性

3 讨论

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，其发生、发展相关危险因素主要有家族或遗传因素、环境因素、生活方式、种族、生育和激素、饮食、吸烟、体质量指数、哺乳等。地区差异、遗传因素与乳腺癌的发病密切相关。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与乳腺癌的易感性逐渐成为人们研究的热点。目前CYP19基因SNP与维吾尔族乳腺癌的研究报道少见，维吾尔族乳腺癌较汉族乳腺癌有自身的临床及病理特点。有文献［1］报道维吾尔族乳腺癌临床分期偏晚，以Ⅱ期、Ⅲ期为主，且术后病检淋巴结转移率较汉族高，提示预后较汉族差，有文献［2］提示维吾尔族乳腺癌免疫组化指标ER、PR、Her-2、nm23、MDR、LRP及ki-67蛋白表达不存在民族差异。故研究维吾尔族乳腺癌特点对新疆地区乳腺癌防治有重要的意义。

细胞色素P450［3］是能够影响雌激素转化生成及代谢的物质，分子量为53KDa或49KDa，是由CYP19基因编码，其基因位于人15号染色体q21.1，由9个外显子组成，本研究选取的多态位点是在3＇-端非编码区的rs10046位点，存在C-T单核苷酸的多态性［4］。由于CYP 19基因上的单SNP可以催化雄烯二酮和睾酮激素分别转化为雌酮和雌二醇［5－7］，是雌激素生物合成中的关键酶和限速酶，使雌激素的合成受到影响，从而调控雌激素的水平。

CYP19基因所编码的酶为雌激素酶合成关键，ER（雌激素受体）和PR（孕激素受体）是近年来乳腺癌研究最多的指标，在乳腺癌的发生发展和预后过程中，为敏感指标，因此CYP19基因多态性在相关雌激素受体表达上可能有一定的相关性。国内研究［8］则表示CYP19A1携带等位基因与ER、PR相关，其中T等位基因可增加ER表达阴性的乳腺癌的发病风险，尤其是绝经前的妇女表现明显。但本研究中rs10046位点多态性未发现TC、TT基因型与ER、PR表达的关系。研究结果显示CYP19基因rs10046位点多态性与对照组的分布存在差异。人类基因多态性在阐明人体对疾病的易感性与耐受性、疾病临床表现的多样性以及对药物治疗的反应性上都起着重要的作用。基因多态性与临床表型的研究可以阐明基因型与表型之间的联系，在疾病的发生、发展及转归等方面也有重要的作用。根据基因多态性的特点用药，将会使临床治疗符合个体化要求。研究探讨该基因多个位点基因多态性与维吾尔族乳腺癌的关系，为个体化治疗乳腺肿瘤提供理论基础。

［1］张建军，王闽全.维、汉族乳腺癌患者临床病理特征对比分析［J］.新疆医科大学学报，2010，33（2）：199-200.

［2］艾司克尔·阿尤甫，张明帅，吐鲁洪·沙列尔，等.新疆维、汉民族乳腺癌免疫组织化学指标对比研究［J］.新疆医科大学学报，2011，34（12）：1347-1349.

［3］Jongen VH，Bri¨et JM，de Jong RA，etal.Aromatase，cyclooxygenase 2，HER-2/neu，and p53as prognostic factors in endometrioid endometrial cancer［J］.International Journal of Gynecological Cancer，2009，19（4）：670-676.

［4］Olson SH，Orlow I，Bayuga S，etal.Variants in hormone biosynthesis genes and risk of endometrial cancer［J］.Cancer Causes ＆ Control，2008，19（9）：955-963.

［5］Miyoshi Y，Iwao K，Ikeda N，etal.Breast cancer risk associated with polymorphism in CYP19in Japanese women［J］.International Journal of Cancer，2000，89（4）：325-328.

［6］Lee KM，Abel J，Ko Y，etal.Genetic polymorphisms of cytochrome P450 19and 1B1，alcohol use，and breast cancer risk in Korean women［J］.British Journal of Cancer，2003，88（5）：675-678.

［7］Song CG，Hu Z，Yuan WT，etal.Effect of R264C polymorphism in CYP19A1gene on BRCA1/2-negative hereditary breast cancer from Shanghai population of China［J］.Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi，2006，23（2）：181-183.

［8］Fasching PA，Loehberg CR，Strissel PL，etal.Single nucleotide polymorphisms of the aromatase gene（CYP19A1），HER2/neu status，and prognosis in breast cancer patients［J］.Breast Cancer Research and Treatment，2008，112（1）：89-98.