高盐诱导幽门螺杆菌致蒙古沙土鼠胃部病变的研究

柳云恩，施琳，张玉彪，徐婷婷，张继存，侯明晓

（沈阳军区总医院全军重症战创伤实验室·辽宁省重症创伤器官保护研究重点实验室，沈阳 110840）

幽门螺杆菌（H.pylori）在全球人群中的感染率高达50%，它与慢性胃炎、消化性溃疡及胃癌的发生密切相关［1］。H.pylori感染的大部分宿主人无任何症状，少数发展为胃炎及胃癌。蒙古沙土鼠（MGs）腺胃结构和功能与人类极其相似，极少患自发性胃炎。H.pylori不仅能长期在MGs胃黏膜定植，且胃黏膜发生的病理变化与人类相似。溃疡分离株TN2GF4感染MGs，可出现活动性胃炎、溃疡和高分化腺癌［2］。溃疡分离株7.13感染MGs 14w后，33%MGs发生高分化腺癌，18w后，50%MGs发生高分化腺癌［3］，其子代菌株B128仅能导致MGs发生轻度溃疡和胰腺炎［4］。

高盐饮食及遗传因素是胃癌发生的危险因素，长期高盐饮食的MGs易发生萎缩性胃炎及肠化生［5］，高盐造成胃黏膜短暂性损伤，破坏黏膜表面黏液屏障，利于H.pylori在胃内定植［6］。用含不同盐浓度培养基培养的H.pylori26695，cagA蛋白表达随盐浓度升高而增加［7］，而经高盐诱导后G27H.pylori菌株逐渐停止繁殖，最终死亡［8］。结果提示H.pylori对高盐环境的耐受能力存在菌株的异质性，某些来源的H.pylori菌株对高盐环境更敏感。目前关于高盐诱导H.pylori菌株致病能力的研究仍停留在体外实验阶段，高盐环境诱导不同来源H.pylori在体内的致病能力尚未见报道。本研究探讨高盐环境培养的H.pylori菌株对MGs胃黏膜的损伤，旨在阐明在体内环境下高盐对H.pylori致病变作用的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

90只雄性SPF级MGs，6周龄，购自浙江省医学科学院实验动物中心。动物饲养环境：室温23±2℃，相对湿度40%～60%，12h明暗循环，噪音＜60dB，自由摄食饮水。试验过程完全接受本中心动物管理委员会（IACUC）监督。

1.2 H.pylori菌株培养及鉴定

胃癌分离H.pylori株和高盐诱导胃癌H.pylori株。将细菌复苏，接种于含7%脱纤维羊血，0.4%IsoVitaleXEnric-hment（USA，Becton Dickinson），0.08%两性霉素 B（USA，sigma），0.2%万古霉素（USA，lilly）和0.5%磺胺增效剂（USA，sigma）的脑心浸液琼脂培养基（USA，B-ecton Dickinson），在37℃，含5%O2、10%CO2、85%N2，相对湿度95%的三气培养箱中培养。幽门螺杆菌鉴定采用典型形态学观察，尿素酶实验，Giemsa染色及PCR技术。

1.3 H.pylori接种

MGs观察及适应环境7d后，将90只MGs随机分成对照组（n＝30只）、H.pylori组（n＝30只）和高盐诱导H.pylori组（n＝30只）。所有MGs在接种前16h禁食、禁水，实验组分别经灌胃针注入H.pylori或高盐诱导H.pylori（1×108CFU/mL）1mL，对照组仅灌喂生理盐水，均1次/d，连续3d，连续观察73w。

1.4 病理学检查

接种H.pylori后第13周及26周，每组分别处死5只MGs，第73周处死所有存活MGs。处死前MGs禁食禁水12h，乙醚吸入麻醉，对MGs胃黏膜进行仔细的大体观察。从前胃、腺胃至十二指肠纵向切成3～5mm宽条块，石蜡包埋制作病理组织切片。

1.5 统计学分析

采用SPSS 18.0统计学软件进行χ2检测，比较细菌定植密度及病变发生率等计数资料的组间差异，所有统计检验均为双侧概率检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 H.pylori在MGs胃黏膜定植能力

从13～73w，对照组所有MGs胃黏膜均未发现H.pylori感染；H.pylori组及高盐诱导H.pylori组MGs胃黏膜均发现细菌定植，而高盐诱导H.pylori组细菌定植密度明显降低（P＜0.05）（见图1）。

图1 免疫组化染色结果

2.2 H.pylori致MGs胃黏膜大体改变

从13～73w，对照组MGs胃黏膜未发现病变。13～26w，高盐诱导H.pylori组胃黏膜糜烂/溃疡发生率显著高于H.pylori组（P＜0.05），且黏膜糜烂/溃疡程度较H.pylori组重（见图2）。

图2 MGs胃黏膜糜烂/溃疡改变

2.3 H.pylori致MGs胃黏膜病变差异

对照组MGs胃黏膜未见明显异常。高盐诱导H.pylori组MGs胃黏膜发生慢性炎症、变性、腺体萎缩及肠化生的发病率均明显低于H.pylori组（P＜0.05）；糜烂/溃疡及小凹上皮增生发生率明显高于H.pylori组（P＜0.05）。

3 讨论

H.pylori通常聚集在表面黏液层内或黏附在表面上皮上，极少寄居在腺体黏液内，当胃黏膜发生慢性炎症或弥漫性糜烂/溃疡时，易导致黏膜上H.pylori定植密度明显下降［9］。高盐环境是否影响H.pylori的定植能力尚不明确。本研究发现，经高盐诱导H.pylori在MGs胃黏膜的定植密度明显降低，体外采用高盐诱导H.pylori与GES-1细胞共培养，发现高盐诱导H.pylori黏附细胞的能力明显下降［10］。有研究发现高盐饮食能导致小鼠胃黏膜损伤，从而有利于H.pylori在胃黏膜定植［11］。而Loh等［7］则发现高盐环境易造成H.pylori活力降低及形状改变，不利于在胃黏膜定植，与本实验结果类似。

高盐诱导H.pylori组导致MGs胃黏膜病变与H.pylori组明显不同，高盐诱导H.pylori组更容易导致黏膜小凹上皮增生和糜烂/溃疡等病变，而H.pylori组易诱发黏膜炎症及萎缩性病变。Fox等［6］发现0.25%盐导致动物胃体及胃窦黏膜小凹上皮伸长，壁细胞多灶性减少，黏膜或黏膜下层炎症反应不明显。高盐饮食和H.pylori感染以协同作用的方式加重MGs黏膜损伤，黏膜损伤势必启动自身的修复程序，导致胃黏膜反应性增生。然而，有研究［12］认为胃黏膜增殖程度与慢性炎症刺激相关，而与H.pylori感染无关。有研究认为H.pylori生长的最适盐浓度是0.5%～1%，2%盐浓度抑制其生长［13］。前期体外实验研究发现高盐诱导胃癌来源的H.pylori，CagA及UreB毒性蛋白仍保持较高水平。本研究发现高盐诱导H.pylori的致病性与常规培养的H.pylori存在显著差异，可能与高盐环境导致H.pylori某些特异性毒性蛋白表达改变有关。

总之，高盐诱导H.pylori在体内的致病能力发生改变，高盐诱导后易诱发胃黏膜增殖、糜烂溃疡和肥大细胞瘤发生，高盐诱导H.pylori菌株致病能力改变的具体机制，有待进一步深入研究。

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