山楂叶总黄酮对大鼠慢性脑缺血时星形胶质细胞GFAP表达的影响

封献敬，曹娜娜，檀荣方，许 丽，武世超，吴晓光

(1.承德医学院临床医学系2011级，河北承德 067000;2.指导老师)

中枢神经系统主要由神经元和神经胶质细胞组成，其中星形胶质细胞数量最多，约占胶质细胞总数的70%。它不仅对神经元起支持、保护和营养作用，更能促进神经元的生长，提高神经元兴奋活性。但当慢性脑缺血时，星形胶质细胞过度反应性增生，可产生多种细胞因子和炎性介质，并可通过释放细胞毒性物质和炎症介质发挥神经毒性作用，抑制神经的再生功能，加重神经元的损伤。胶质源性纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic portein，GFAP)是星形胶质细胞特有的一种细胞骨架蛋白，GFAP表达的多少可以反映星形胶质细胞的功能状态。研究表明，山楂叶总黄酮(total flavone of hawthorn leaf，TFHL)对脑缺血神经元损伤具有保护作用[1]。但TFHL对星形胶质细胞的影响未见报道。本研究通过观察TFHL对慢性脑缺血损伤后星形胶质细胞反应性增生的影响，进一步探究TFHL对慢性脑缺血神经组织的干预机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 成年雄性清洁级Spague-Dawley大鼠，24只，体质量250-280g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号:scxk(京)2006-2009。大鼠适应饲养一周，随机分为假手术组、模型组、TFHL组，每组8只。

1.2 药物与试剂 TFHL，山西振东泰盛制药有限公司提供，纯度98%，用蒸馏水配制，浓度为140mg/ml。GFAP抗体(免抗)、SABC免疫组化试剂盒、DAB试剂盒，均购自武汉博士德生物科技有限公司。

1.3 动物模型制备及给药 模型组、TFHL组均采用结扎双侧颈总动脉的方法制备慢性脑缺血模型:2%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉，颈部正中矢状切口，钝性分离皮下组织及筋膜，在颈动脉三角处游离出双侧颈总动脉，结扎并切断双侧颈总动脉，缝合切口，术后24h内未苏醒者剔除，并及时补遗。假手术组仅分离双侧颈总动脉，但不结扎。术后第14天开始，TFHL组给予TFHL(140mg/kg/d)灌胃，连续30d。假手术组及模型组给予等量生理盐水灌胃，时间同TFHL组。

1.4 取材及指标检测 2%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛左心室插管灌注固定，取脑组织，梯度酒精脱水，常规石蜡包埋，5μm连续冠状切片，每隔3片取1张，共选5张。免疫组化法检测GFAP的表达:石蜡切片脱蜡至水，3% H2O2孵育，抗原修复;滴加GFAP一抗(1:100稀释)，4℃孵育过夜;滴加二抗工作液，室温孵育30min;滴加三抗SABC室温孵育30min;DAB显色;苏木精复染;梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。在400倍显微镜下，每只动物取3张代表切片，每片随机选取5个视野，显微摄像后，采用MiVnt图像分析系统分析阳性产物面积占视野面积的比值。

1.5 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，数据以均数±标准差(±s)的形式表示，组间比较采用one-wayANOVA方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

GFAP阳性产物为棕黄色颗粒，位于星形胶质细胞胞浆及突起内。假手术组大鼠星形胶质细胞GFAP的表达呈弱阳性，胶质细胞突起较短、较细;与假手术组比较，模型组大鼠星形胶质细胞GFAP的表达增多、并呈强阳性表达，胶质细胞胞体肿胀、突起增粗，出现胶质瘢痕;与模型组比较，TFHL组大鼠星形胶质细胞GFAP的表达明显减少，胞体肿胀减轻。定量分析结果:模型组大鼠GFAP的表达明显高于假手术组(P＜0.01);与模型组比较，TFHL组大鼠GFAP的表达明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见附表。

附表 各组大鼠星形胶质细胞GFAP的表达( ±s)

附表 各组大鼠星形胶质细胞GFAP的表达( ±s)

与假手术组比较:*P＜0.01，与模型组比较:#P＜0.05

组别 剂量(mg/kg/d) GFAP的表达假手术组 - 0.27±0.16模型组 - 1.46±0.67*TFHL组 140 0.97±0.42#

3 讨论

慢性脑缺血引起长期脑灌注不足可以导致神经组织的严重损害，其病理过程不仅包括神经元的变化，而且存在神经胶质细胞的变化。星形胶质细胞是脑内数量最多、分布最广的一种神经胶质细胞，它是中枢神经系统的主要支持成份，参与多种生理反应。在脑损伤后，星形胶质细胞胞体变大，数目增多，出现反应性增生。目前对脑缺血的研究主要集中于如何保护缺血半暗带区的神经细胞，而对胶质细胞，尤其星形胶质细胞的研究较少。

脑缺血时，星形胶质细胞从静止状态活化并增生，形成反应性星形胶质细胞增生，如损伤严重将形成胶质疤[2]。慢性脑缺血可损害海马突触可塑性引起学习记忆能力降低，脑缺血后海马出现过度增殖的胶质细胞以及胶质疤痕的形成不仅影响正常的局部神经回路，而且可能是继发癫痫以及认知功能损害的重要因素[3]。GFAP是星形胶质细胞特异性的标志蛋白，通过调节GFAP表达，有效抑制星形胶质细胞的过度活化，防止胶质疤痕的形成，将是脑保护研究的重点。

本研究显示，模型组大鼠脑组织GFAP的表达明显高于假手术组，提示慢性脑缺血可引起星形胶质细胞过度活化、增生，与文献报道的结果一致[4]。TFHL干预后反应性星形胶质细胞增生的情况较模型组明显改善，提示TFHL能抑制脑缺血诱发的星形胶质细胞过度活化，这可能是其脑保护作用的机制之一。尽管TFHL确有神经保护作用，值得注意的是反应性星形胶质细胞增生是一个动态的形成过程，因此抑制星形胶质细胞过度增生的确切机制仍需进一步深入研究。

[1]李丽静,吴晓光，商亚珍.山楂叶总黄酮对脑缺血再灌注损伤的保护作用机制研究进展[J].承德医学院学报,2013,30(2):148-151.

[2]Rossi D,Brady J,Mohr C.Astrocyte metabolism and signalin during brain ischemia[J].Nat Neurosci, 2007, 10(11): 1377 -1386

[3]Andersson M, Blomstrand F, Hanse E. Astrocytes play a critica role in transient heterosynaptic depression in the rat hippocampa CA1 region[J].J Physiol,2007,585(Pt 3):843 -852.

[4]王摇敏,张秋霞,邹海艳,等.竹节参总皂苷对慢性脑缺血大鼠海马GFAP、GAP-43表达的影响[J].世界中医药,2013,8(2):183-185.