吸入性麻醉药对促炎性细胞因子表达的影响

李 江，李丽莎

（云南省第一人民医院麻醉科／昆明理工大学附属医院，昆明650031）

严重创伤，重大手术创伤、休克、感染、脏器缺血再灌注损失、内毒素血症是围术期常见的现象。围术期过激炎症反应的调控近年来一直是重点研究领域，众多在体及离体的研究显示吸入麻醉药可明显减少心、脑、肺、肝、肾等器官的损伤，保护脏器功能［1－3］，其机制较复杂，涉及很多方面。其中，异氟醚为目前临床最常用的吸入麻醉药物之一，其对炎性因子的影响一直存在争议。因此，本研究观察了吸入麻醉药异氟醚对大鼠促炎性细胞因子表达的影响，旨在为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 选择成年雄性Lewis大鼠，8周龄，体质量200～250g，由上海史莱克动物提供商供应，于上海实验动物中心（SPF级）预检3d，一笼饲养4只，动物室和实验室温度为23℃，12h明暗轮流光照，自由饮食。异氟醚（isoflurane）（河北九派制药有限公司），脂多糖（Sigma公司），生理盐水（山东华鲁制药有限公司），牛胎儿血清（fetal bovine serum，FBS）（Gibco公司），磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS），戊巴比妥钠，5mL离心管，15mL离心管，2mL的一次性注射器，针头（16G），Narcomed 2B麻醉机（Drager公司），有机玻璃麻醉箱（40cm×30cm×30cm）购于北京有机玻璃厂，多功能气体检测仪（Datex－Ohmeda，芬兰），大鼠白细胞介素－2（interleukin－2，IL－2）、干扰素（interferon－gamma，IFN－γ）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor－alpha，TNF－α）、ELISA 试剂盒（博士德公司），Trizol RNA 分离液（美国Promega公司），RT－PCR试剂盒（美国Promega公司），甘油醛－3－磷酸脱氢酶（glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH）、TNF－α 引 物（Invitrogen公司），细胞计数仪 Vi－cellXR（美国 Beckman Coulter），大鼠固定器。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 将24只Lewis大鼠采用随机数字法随机分为3组：正常组、对照组、异氟醚组，每组8只。除正常组之外，其余组均放入密闭有机玻璃麻醉箱内，进气端与麻醉机呼吸回路相连通，出气端接多功能气体检测仪并与大气相通。氧气浓度维持在40%，大鼠保持自主呼吸，容器内温度维持在（23.00±1.00）℃，湿度为（50.00±10.00）%；在此基础上，异氟醚组分别吸入2%的异氟醚。多功能气体检测仪监测容器内异氟醚浓度和氧气浓度，达到设定值（40%O2、2%异氟醚）后即使开始计时。

1.2.2 动物急性炎症模型制备 大鼠在吸入2%的异氟醚后30min尾静脉注射一次脂多糖（5mg／kg）。

表1 3组大鼠BALF中各种炎症细胞数量比较（个，×103，±s）

表1 3组大鼠BALF中各种炎症细胞数量比较（个，×103，±s）

＊：P＜0.05，与对照组比较。

组别 n 巨噬细胞 嗜酸性粒细胞 中性粒细胞 淋巴细胞 总数正常组 8 114.80±85.25 120.09±156.46 0.86±0.86 1.93±0.34 237.67±237.79对照组 8 141.24±27.76 201.20±47.64 1 387.08±254.48 7.99±1.68 1 737.50±304.22异氟醚组 8 129.82±44.20 157.44±41.02 6.43±3.84＊ 2.56±0.73＊ 296.25±78.94＊

表2 3组大鼠BALF和血清中 TNF－α、IL－2和INF－γ表达（n＝8，±s，pg／mL）

表2 3组大鼠BALF和血清中 TNF－α、IL－2和INF－γ表达（n＝8，±s，pg／mL）

＊：P＜0.05，与对照组比较。

组别 n BALF TNF－αmRNA TNF－α血清IL－2 INF－γ正常组 8 0.70±0.19 143.79±4.69＊ 192.44±96.68＊ 10.67±10.67＊对照组 8 1.53±0.49 2 717.30±245.49 6 690.67±530.25 412.78±109.01异氟醚组 8 1.23±0.26＊ 758.63±65.76＊ 2 995.22±419.41＊ 217.25±10.50＊

1.2.3 标本采集 脂多糖静脉注射之前给予30min异氟醚，4h之后，将大鼠麻醉（12mg／mL戊巴比妥钠，5mL／kg），心脏采血收集，然后在气管上开一小口，将针头（16G针头）插入气管内，用止血钳固定，用5mL含1%FBS的PBS液清洗支气管及肺泡3次，如此3遍，共用15mL的支气管灌流液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）冲洗。腹主动脉采血并以12 000r／min离心5min取上清液做ELISA检测IL－2和IFN－γ。将BALF以1 500r／min离心10min，上清液分装置－80℃保存以测定细胞因子（TNF－α），下层细胞用PBS＋1%FBS悬浮（约106／mL），取100μL的细胞悬液，800r／min离心5 min，涂片，晾干，甲醛固定，然后用瑞士－吉姆萨染液，A液染3 min，B液染10min，不同种类细胞计数。最后分离取出肺组织中右上肺做RT－PCR检测TNF－α表达水平。

1.2.4 检测指标 对BALF中的炎症细胞进行细胞计数，以及应用ELISA检测BALF和血浆中的促炎细胞因子（TNF－α、IL－2、IFN－γ）含量。

1.2.5 RT－PCR法检测TNF－αmRNA表达水平 根据RNA提取试剂盒说明书提取RNA，进行逆转录反应（20μL体系）；PCR扩增（25μL体系），引物序列为：TNF－α上游引物5′－CAC CAC GCT CTT CTG TCT ACT GAA C－3′，TNF－α下游引物5′－CCG GAC TCC GTG ATG TCT AAG TAC T－3′，产物长度546bp；GAPDH 上游引物5′－CAC GGC AAG TTC AAT GGC ACA－3′，下游引物5′－GAA TTG TGA GGG AGA GTG CTC－3′，产物长度970bp。产物进行琼脂凝胶电泳，用EB染色，图像采用Quantity One v462凝胶定量分析软件进行分析，以TNF－α与GAPDH扩增条带灰度比值进行统计。

1.3 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，采用Graphpad prism软件对数据进行单因素方差分析，多组间两两比较采用Turkey检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

3组大鼠BALF中各种炎症细胞数量见表1，3组大鼠BALF中TNF－α的表达和大鼠血清中IL－2和INF－γ的含量见表2。

3 讨 论

脂多糖是一个大分子由脂质和多糖价键相连组成，是革兰阴性菌外膜的主要组成部分，被充当内毒素，并在动物中引起强烈的免疫反应，同时也是免疫和炎症系统中的主要激活物，包括巨噬细胞、单核细胞和内皮细胞。它能导致败血性休克、炎症发生、多种器官损伤和细胞因子的释放。

麻醉药物对机体免疫功能的影响已被越来越多的实验所证实。其作用可能是通过对机体应激反应、内分泌调节、神经递质的释放、细胞因子的相互作用及对细胞表面受体和离子通道的影响而引起的。麻醉药物可直接作用于炎症细胞（如影响自然杀伤细胞、单核细胞－巨噬细胞、粒细胞的数目或功能），也可以通过影响炎症介质，包括细胞因子，而起到促进或抑制炎性作用，其中细胞因子在麻醉药物作用中所处的地位日益受到重视。

TNF－α、IL－2和INF－γ都是目前研究最为活跃的促炎细胞因子，它们由炎症细胞激活所释放，能引起强烈的炎症反应。T－和B－淋巴细胞的激活将会导致IL－2的释放，IL－2与其受体结合诱导一系列的信号级联反应，引起免疫缺陷或自身免疫性疾病。INF－γ具有免疫调节作用，是一个病毒复制的抑制物，同时也是Th1淋巴细胞及其介导的免疫反应的标志。TNF－α主要由单核－巨噬细胞分泌，在体内外均能刺激IL－1的产生。本实验研究发现，吸入性麻醉药物异氟醚能够影响TNF－α、IL－2和INF－γ的表达，减少它们的产生。这说明吸入性麻醉药物有可能改变手术或炎症产生的促炎细胞因子和抗炎细胞因子的平衡。事实上，许多麻醉药物能够影响促炎细胞因子的表达。研究证实，异氟醚等多种吸入麻醉药抑制器官的缺血再灌注损伤也与其抗炎、抗凋亡作用相关，减少NF－κB的激活，减少TNF－α、IL－1、ICAM－1和iNOS的表达，增强抗凋亡蛋白Bcl－2等表达。异氟醚可以通过抑制ICAM－1的表达和减少中性粒细胞的迁移以减轻大鼠肝局部缺血再灌注的损伤［4］。另外，异氟醚还能通过下调小鼠血浆TNF－α和IL－6水平，减少了腹膜炎败血症所致的肝肾功能损害和死亡率［5］。本研究表明，大鼠静脉注射脂多糖诱导急性炎症，导致BALF中炎症细胞增多以及BALF和血浆中 TNF－α、IL－2和INF－γ的表达增加，这暗示了炎症促使炎症细胞渗漏和激活并释放出炎症细胞因子从而导致炎症反应的加剧。通过用异氟醚预处理可以明显地抑制BALF中炎症细胞（尤其是中性粒细胞和淋巴细胞）增加以及BALF和血浆中 TNF－α、IL－2和INF－γ的表达，该结论与相关研究一致。这充分地说明了异氟醚具有抗炎作用，能够抑制促炎细胞因子的产生，在一定的程度上减缓了炎症反应。Adams等［6］研究也表明，大鼠腹腔注射吸入麻醉药能够降低脂多糖诱导的IL－6／IL－10的比率并能减轻炎症反应。薛纪秀等［7］研究表明丙泊酚和异氟醚能减少胰岛素（IN）、TNF－α、IL－6和胰岛素抵抗指数及在一定程度上减轻了应激反应。因此。这对今后临床上麻醉药物的使用提供了理论指导和现实基础。也有研究表明，利多卡因预处理可抑制内毒素诱导的兔促炎因子IL－6、TNF－α的释放和减轻内毒素诱发的兔肺毛细血管通透性增加、肺部炎症细胞浸润及内皮细胞损伤［8］。但也有实验显示，直接给予大鼠异氟醚上调了大鼠肺脏炎性因子的水平［9］。这可能与实验条件及炎症模型不同有关。尽管有点矛盾，但更多的研究证明，卤族类吸入性麻醉剂预处理对肺缺血再灌注损伤和神经具有保护作用［10－11］。

Flondor等［12］研究表明，大鼠静脉注射内毒素脂多糖后用吸入性麻醉药异氟烷处理可以抑制促炎细胞因子TNF－α及IL－1β的释放，产生抗炎作用。同时，体外研究也表明，麻醉药丙泊酚和氯胺酮可抑制脂多糖刺激的PBMC细胞因子的表达［13］。Weber等［14］研究表明，异氟烷能有效抑制人的脐静脉内皮细胞所产生的TNF－α和血管细胞黏附分子－1的分泌。与本研究结果一致。

目前，不同的麻醉药物对细胞因子产生的影响还存在一定的争议，其机制不是十分清楚。本研究表明了吸入麻醉药预处理通过抑制促炎细胞因子产生抗炎作用，可应用于手术上的免疫和抗感染等方面。因此，根据患者病情、手术大小，尤其是那些免疫功能异常、感染、创伤的高危手术患者，选择合适的麻醉药物维持细胞因子平衡，以调节机体免疫，具有重要的临床意义。

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