犬隐孢子虫病研究进展

石 凯，邓俊良，陈兆国，米荣升，黄 燕，周 鹏

（1.四川农业大学动物医学院，四川雅安625014；2.中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点实验室 中国农业科学院动物源性食品安全研究中心，上海200241）

隐孢子虫（Cryptosporidiumspp.）是一种广泛寄生于鱼类、两栖类、爬行类、禽类、哺乳类，并能够引起包括人在内的多种动物发生以胃肠黏膜上皮细胞损伤性腹泻和卡他性呼吸道炎症为主要临床症状的人兽共患病的原虫。隐孢子虫种类较多，从1907年Tyzzer第一次发现并于1910年命名鼠隐孢子虫（Cryptosporidium muris）开始［1］，到目前为止被大多数人所公认有效命名的隐孢子虫共有23种，超过40多个基因型［2］。

寄生于犬科动物的隐孢子虫主要为犬隐孢子虫（C.canis）［2］，此外，还有微小隐孢子虫（C.parvum）、鼠隐孢子虫、火鸡隐孢子虫（C.meleagridis）［3］，这些虫种均可感染人类。但微小隐孢子虫、鼠隐孢子虫和火鸡隐孢子虫感染犬后一般呈隐性经过，不表现出明显症状，只有犬隐孢子虫在犬隐孢子虫病（Cryptosporidiosis）中具有临床意义。犬是人们日常生活中的伴侣动物，与人类接触频繁，其携带的人兽共患隐孢子虫种很容易传染给人，无论是免疫功能正常的人，还是免疫功能存在缺陷的人群，均有感染犬隐孢子虫的报道［4］，所以犬源隐孢子虫可直接危害人类的生活与健康。目前国内外学者对犬隐孢子虫的研究尚少，本文就近年来国内外在犬隐孢子虫的病原学、寄生部位与致病性、流行病学、检测和防治等方面的研究现状做一综述。

1 病 原

1.1 犬隐孢子虫的发现与分类

犬隐孢子虫病最早由Tzipori和Campbell于1981年报道，他们在20只犬血清样品中检测出16份阳性隐孢子虫抗体。1983年，Wilson等报道了第1例犬感染隐孢子虫病的临床病例，在1只1周龄患急性腹泻的幼犬中发现了隐孢子虫。但这些病例没有通过基因学方法检测，并不能确定是否由犬隐孢子虫感染所引起。起初犬隐孢子虫被认为是微小隐孢子虫牛基因型或人基因型，因为犬隐孢子虫在形态以及子孢子表面抗原上和后两者相同。1999年，Xiao L等［5］从犬的粪便中分离得到隐孢子虫卵囊，利用核糖体小亚基RNA（small subunit ribosomal RNA，SSU rRNA）基因进行扩增和测序，将该序列同其他隐孢子虫序列一同构建系统进化树，发现该分离株位于一个独立的分支上，将其命名为微小隐孢子虫犬基因型。同年，Pieniazek N J等［6］也从携带HIV的病人粪便中检测到隐孢子虫卵囊，经SSU rRNA基因扩增后测序，与Xiao L等［5］报道的微小隐孢子虫犬基因型序列同源性达到100%，为同一个基因型。2001年，Fayer R等［7］又从病犬和 HIV感染病人中分离到该基因型虫株，并进行动物感染试验和基于SSU rRNA、卵囊壁蛋白（Cryptosporidiumoocyst wall protein，COWP）与热休克蛋白70（heat－shock protein 70，HSP 70）基因的系统进化树分析，结果显示该基因型为一个新种，将其命名为犬隐孢子虫，目前该虫种已经得到广泛认可。

1.2 犬隐孢子虫的基因型研究

研究发现，犬隐孢子虫并不只有一种基因型，目前发现并命名的有3种基因型，即犬隐孢子虫犬基因型（C.canisdog genotype）、郊狼基因型（C.caniscoyote genotype）和狐基因型（C.canisfox genotype）［8］。这几种基因型都可感染所有的犬科动物，但是狐基因型和郊狼基因型只在野生犬科动物中有报道。另外，日本Satoh M等［9］于2006年报道，日本主岛北部的宫城地区发现的犬隐孢子虫种和美国等其他多个地区所报道的犬隐孢子虫种的18S rRNA略有不同，在长度为1 741bp的18SrRNA序列中，第1 684位和第1 685位置的碱基发生了替换，与其他地区相比有0.11%的差别。这表明不同地区之间的犬隐孢子虫也存在着一定的种内隔离。

1.3 形态特征

犬隐孢子虫卵囊呈椭圆球形，无色或苍白色。在改良抗酸染色标本中，卵囊为玫瑰红色，背景为蓝绿色，对比性很强，残体为暗黑色或棕色颗粒，成熟卵囊内含4个裸露的子孢子和少量残体。

犬隐孢子虫卵囊的形态大小在不同地区报道的有所差别，具体如表1所示，这表明犬隐孢子虫在形态学上存在多样性，这可能是不同地区外界环境不同，犬隐孢子虫在种内也存在一定的差异。另外，在光学显微镜和电子显微镜镜下，其大小和形状与其他隐孢子虫相似并互有重合，所以形态学上的差异不能作为隐孢子虫种鉴别的依据。

表1 不同地区犬隐孢子虫卵囊形态比较Table 1 Comparison of oocyst morphology of Cryptosporidium canis isolated from different regions

2 犬隐孢子虫寄生部位与致病性

2.1 宿主特异性

犬隐孢子虫不能感染小鼠，而微小隐孢子虫能够感染免疫抑制小鼠；犬隐孢子虫能够感染牛，而人隐孢子虫则不能感染［6］，这也是将其作为一个独立虫种的主要依据之一。但当人免疫抑制或者免疫功能不全时也会感染犬隐孢子虫，现已有多例犬隐孢子虫感染艾滋病病人和健康儿童的报道。

2.2 寄生部位

犬隐孢子虫一般被认为是肠道寄生虫，寄生于小肠上皮细胞的刷状缘纳虫空泡内。早期曾有报道称犬隐孢子虫在有寄生虫和病毒感染的情况下可寄生于犬胃黏膜和呼吸道黏膜［10］。但当时还未命名犬隐孢子虫，且没有经分子鉴定，不能确诊是否是犬隐孢子虫感染。2003年，Miller D L等［12］报道犬胃部隐孢子虫感染，一只8周龄雌性约克夏犬胃部和肠部黏膜刮取物中发现犬隐孢子虫，并且寄生于胃部黏膜的卵囊数量多于肠道黏膜，这表明犬隐孢子虫也可寄生于胃部上皮细胞，但其原因和机理并不明确。

2.3 内生发育史

当宿主吞食成熟卵囊后，在消化液的作用下，子孢子在小肠脱囊而出，先附着并侵入肠上皮细胞，在被侵入的胞膜与胞质之间形成纳虫空泡，虫体先在空泡内无性繁殖发育为滋养体，经3次核分裂发育为含有8个裂殖子的Ⅰ型裂殖体。Ⅰ型裂殖子被释出后侵入其他上皮细胞，发育为第2代滋养体。第2代滋养体经2次核分裂发育为含4个裂殖子的成熟Ⅱ型裂殖体。此裂殖子释出后侵入肠上皮细胞发育为雌、雄配子体，进入有性生殖阶段。雌配子体进一步发育为雌配子，雄配子体产生16个雄配子，雌雄配子结合形成合子，然后发育为卵囊，进入孢子生殖阶段。

2.4 致病性

犬隐孢子虫的致病性主要表现在两个方面，一是寄生性因素，另一个就是机体免疫反应。寄生性因素体现在消化道感染，虽然不引起明显的肉眼病变，但在病理组织学上呈现典型的肠炎变化，营养物质消化、转运、吸收出现障碍，引起消化不良和腹泻。机体免疫反应体现在犬隐孢子虫感染后，宿主CD3＋、CD4＋T细胞百分率降低，T细胞活化障碍，不能分泌足够的细胞因子参与免疫应答，使感染持续存在［13］。并且机体免疫功能下降，增加了其他寄生虫和传染病的发生几率。

3 犬隐孢子虫病流行病学

犬隐孢子虫病传染源是人和犬排出的卵囊，病愈后机体仍可排出卵囊达数月之久。这些卵囊对外界环境有很强的抵抗力，在潮湿的环境下能够存活数月。犬隐孢子虫病传播主要是通过粪口途径，犬可通过其食粪性、梳理皮毛、野外狩猎、食用污染的食物或饮水等接触卵囊而进入消化道引起感染，造成了犬隐孢子虫病的广泛传播。

犬隐孢子虫病一年四季都可发生，呈全球性分布，但在潮湿地区和季节多发。从2001年至今，美国、澳大利亚、日本、英国、巴西、意大利、伊朗等多个国家先后报道了犬隐孢子虫病流行情况，其感染率从0.3%～9.3%不等［9，11－18］。中国部分地区也开展了犬隐孢子虫病流行病学调查，其感染率在3.71%～30.18%之间［20］。造成感染率差异较大的原因，除了可能与样本的采集地点、样本数等相关外，还可能与犬隐孢子虫病间歇性排卵的独特特性以及不同的检测方法有关。

在感染虫种上，犬隐孢子虫占16.7%～100%，其中家养驯化犬科动物感染的虫种主要为犬隐孢子虫，而野生犬科或流浪驯化犬科动物多感染有其他虫种。例如，Trout J M等［16］在美国宾夕法尼亚州对郊狼粪便进行采样检查，发现隐孢子虫总感染率为27.28%，其中犬隐孢子虫感染率为22.73%，鼠隐孢子虫感染率为4.55%。这可能与野外生活环境中能够摄食或接触鼠科动物相关。

此外，犬感染隐孢子虫还与犬的生理因素，包括年龄、营养健康状况、生活环境、体型大小等有关，其中腹泻犬的感染率高于健康犬的感染率；幼犬比成年犬更容易感染［17］；小型品种犬比大型犬更容易感染；流浪犬、舍养犬和经常聚集的犬［18］比家养犬更容易感染。例如，2006年意大利的Giangaspero等调查了240只犬的隐孢子虫感染情况，其中舍养犬和家养犬各半，结果发现舍养犬的隐孢子虫感染率为5.00%，高于家养犬的1.68%；腹泻犬隐孢子虫的检出率高于非腹泻犬。造成这种结果的可能原因是幼犬免疫功能比较差，随着年龄的增长，其免疫功能逐渐增强，感染率和感染强度逐渐降低；小型品种犬身体状况比较差，免疫力和抵抗力均较差；流浪犬和舍养犬的生活条件较差，免疫力较低，生活环境容易被污染，也容易发生交叉感染；腹泻犬多感染有其他病原，如犬细小病毒、博卡病毒［21］等，这些病原主要损害消化道，破坏消化道免疫机能，而犬隐孢子虫主要寄生于消化道，这也使腹泻犬感染隐孢子虫的几率高于健康犬。

4 犬隐孢子虫病的诊断

由于犬隐孢子虫多呈隐性感染，感染者往往是带虫者，可以只向外界排出卵囊，而不表现出任何临诊症状。一些发病犬，即使有明显症状，也往往属于非特异性，只能作为诊断的参考指标，而不能凭此做出确诊［22］。而且犬隐孢子虫在形态学、抗原特性上与其他种隐孢子虫比较相似，难以区别，鉴于这些原因，一类依赖于核酸序列分析的基因学检测技术开始应用于犬隐孢子虫的检测。

基因学诊断主要包括两大类，一类是探测隐孢子虫卵囊特定基因位点的原位杂交（situ hybridization）技术，主要针对在细胞内大量存在的RNA小亚基的可变区进行杂交。虽然原位杂交技术对隐孢子虫卵囊的检测比较敏感，而且能够检测到卵囊RNA小亚基转录的时期，对于研究卵囊感染性变化和转录时期的关系提供了研究方向，但是并不能区分其虫种和基因型，这在一定程度上限制了它的运用。另一类是针对DNA的聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）和分子标记技术，这些方法不仅准确性高，而且能够提高对隐孢子虫种群遗传学、种群分布和流行病学的了解和认识。但是这些检测方法都需要新鲜或者冷冻粪便样品，而犬感染隐孢子虫后，卵囊排出量较少且呈间歇性排出，很容易漏检，所以犬隐孢子虫的实际感染率往往大于检出率。

5 犬隐孢子虫病的防控

5.1 预防

隐孢子虫病患犬和病原携带犬能排出大量的卵囊，而普通消毒方法对卵囊的灭活效果并不理想，并且也没有商品化的疫苗用于临床。所以加强消毒和卫生管理，是降低接触犬隐孢子虫和感染犬隐孢子虫概率的主要方法。

5.1.1 卫生管理 要经常清洁消毒病犬污染的环境及笼舍，及时妥善处理病犬的粪便、污水和污物等，提供独立的清洗消毒设施，注意食物和饮水卫生，避免交叉感染。健康宠物犬要经常检查健康状况，溜犬时避免接触污水、流浪犬、野生动物，避免野外摄猎活动等。

5.1.2 消毒 由于隐孢子虫卵囊有着坚硬的外壳，一般消毒剂无法通过卵囊的外脂质层而攻击到内层稳定的糖蛋白层，灭活感染阶段的子孢子而限制了其应用的效果。有研究证实表面活性剂可以提高卵囊表面的湿润度，增强普通消毒剂的渗透能力，从而提高消毒效果［23］。臭氧在所有消毒剂中效果最好，1mg／L的臭氧作用5min之后就可以灭活90%以上的卵囊，而1.3mg／L的二氧化氯作用60min才可以达到相同效果［24］。湿热消毒灭活卵囊是最理想的消毒方法，卵囊暴露在45℃～60℃的湿热条件下5min～9min就可以使卵囊完全失去感染活力。

5.2 治疗

目前还没有特效药物用于犬隐孢子虫病的临床治疗，现阶段用于治疗的药物根据使用方法和来源可以分为以下几种：

5.2.1 中草药 对隐孢子虫病有治疗效果的中药主要有大蒜素、苦参合剂、黄芪多糖、当归补血汤、补骨脂、双氢青蒿素等［25］。大部分学者认为中药是通过提高自身免疫力，利用机体的自愈能力达到治疗的效果。也有研究证明某些中药在提高机体免疫力的同时还能杀伤卵囊，降低感染程度，减轻肠道病理变化。另外，中药中的一些鞣酸能够保护胃肠黏膜，减轻患犬的腹泻症状。从目前研究结果来看，中药对隐孢子虫病有一定疗效，但作用机理和有效成分不是特别明确，需要进一步研究。

5.2.2 化学合成药 近几十年来，治疗隐孢子虫病的化学药物的筛选研究已成为人们关注的热点，但大量体内外试验表明目前还没有特效药物［26］。目前国内外报道［27］临床用于犬隐孢子虫病治疗的有效药物包括阿奇霉素（azithromycin），每天每千克体重10mg口服，直至临床症状消失；硝唑尼特（nitazoxanide），每千克体重口服25mg，每天2次，至少7d；巴龙霉素（paromomycin），每千克体重口服125 mg～165mg，每天2次，至少5d；泰乐菌素（tylosin），每千克体重口服10～15mg，每天2次，共15 d。另外，最新研究表明，常山酮（halofuginone）、螺旋霉素（spiramycin）、金精三羧酸（aurintricarboxylic acid）、姜黄色素（curcumin）、苯并咪唑（benzimidazole）、米替福 新 （miltefosine）、癸 氧 喹 酯 （decoquinate）等在动物体内外试验中也有一定的疗效［27］。

但这些药物的临床效果取决于机体免疫状况、用药疗程、联合用药等多方面因素；并且还存在清除卵囊不彻底、疗程长、毒性大、仅在免疫正常机体有效、停药后易复发等缺点，例如，巴龙霉素不能应用于有血便的隐孢子虫病患犬，它会通过损伤的肠道进入机体，产生很强的肾脏毒性和耳毒性。所以这些药物的临床应用还需进一步研究改善。

5.2.3 生物制剂 国内外研究人员用高免初乳、高免血清、单克隆抗体、牛转移因子、裂解肽及白介素等生物制品，直接提高或刺激机体提高免疫功能来达到免疫治疗的效果。但由于生物制品成本较高，疗效不很确切，故大规模应用尚需进一步验证。

5.2.4 其他药物 止泻药和补液药对犬隐孢子虫引起的腹泻症状和脱水症状也有一定的改善。例如，Paraud C等［28］报道动物灌服混合活性炭的木酢液（wood vinegar liquid），能够使卵囊排出数量减少，并能显著减轻腹泻症状。另外还有最近研究比较热门的分子靶标抑制剂等，可以从内部抑制隐孢子虫或卵囊营养物质的合成和代谢［29］。

6 展望

目前，国内对犬隐孢子虫的研究多停留在利用子孢子抗原蛋白建立检测技术，或采用常规的浓集法、染色法技术进行调查研究，对于犬隐孢子虫的病原学、生物学特性、病理学、基因组学等研究还比较少，对犬感染的隐孢子虫基因分型或相关研究工作还有待加强。

随着对隐孢子虫蛋白组学和基因组学研究的深入，人们对犬隐孢子虫的生物学特性的了解会越来越深入，对其分子流行病学和致病机理的研究将更加深刻，其检测方法将更加快捷有效，治疗药物越来越多，相信不久的将来隐孢子虫病疫苗的研究也将取得重要进展。

［1］ Fayer R.Taxonomy and species delimitation in Cryptosporidium［J］.Exp Parasitol，2010，124（1）：90－97.

［2］ 张国恩.隐孢子虫rP23间接ELISA诊断方法及体内瞬时转染系统的构建［D］.上海：中国农业科学院上海兽医研究所，2011.

［3］ 胡 霖.四川省部分地区犬贾第虫和隐孢子虫分子遗传特征及其种系发育研究［D］.四川雅安：四川农业大学，2011.

［4］ Xiao L，Cama V A，Cabrera L，et al.Possible transmission of Cryptosporidiumcanisamong children and a dog in a household［J］.J Clin Microbiol，2007，45（6）：2014－2016.

［5］ Xiao L，Limor J，Morgan U M，et al.Genetic diversity within Cryptosporidium parvumand related Cryptosporidiumspecies［J］.Appl Environ Microbiol，1999，65（8）：3386－3391.

［6］ Pieniazek N J，Bornay－Llinares F J，Slemenda S B，et al.New Cryptosporidiumgenotypes in HIV infected persons［J］.Emerg Infect Dis，1999，5（3）：444－449.

［7］ Fayer R，Trout J M，Xiao L，et al.Cryptosporidium canis n.sp.from domestic dogs［J］.J Parasitol，2001，87（6）：1415－1422.

［8］ Feng Y.Cryptosporidiumin wild placental mammals［J］.Exp Parasitol，2010，124（1）：128－137.

［9］ Satoh M，Matsubara－Nihei Y，Sasaki T，et al.Characterization of Cryptosporidium canis isolated in Japan［J］.Parasitol Res，2006，99（6）：746－748.

［10］ Fall A，Thompsona R C A，Russell P，et al.Morphology is not a reliable tool for delineating species within Cryptosporidium［J］.J Parasitol，2003，89（2）：399－402.

［11］ Thomaz A，Meireles M V，Soares R M，et al.Molecular identi－fication of Cryptosporidiumspp.from fecal samples of felines，canines and bovines in the state of São Paulo，Brazil［J］.Vet Parasitol，2007，150（4）：291－296.

［12］ Miller D L，Liggett A，Radi Z A，et al.Gastrointestinal cryptosporidiosis in a puppy［J］.Vet Parasitol，2003，115（3）：199－204.

［13］ Scorza V.Update on the diagnosis and management of Cryptosporidiumspp infections in dogs and cats［J］.Top Companion Anim Med，2010，25（3）：163－169.

［14］ Abe N，Sawano Y，Yamada K，et al.Cryptosporidiuminfection in dogs in Osaka，Japan［J］.Vet Parasitol，2002，108（3）：185－193.

［15］ Ryusaku Y，Makoto M，Isao K，et al.Survey and molecular characterization of Cryptosporidium and Giardia spp.in owned companion animal，dogs and cats，in Japan［J］.Vet Parasitol，2010，174（3－4）：313－316.

［16］ Trout J M，Santin M，Fayer R.Giardia and Cryptosporidium species and genotypes in coyotes （Canis latrans）［J］.J Zoo Wildl Med，2006，37（2）：141－144.

［17］ Mirzaei M.Epidemiological survey of Cryptosporidiumspp.in companion and stray dogs in Kerman，Iran［J］.Veterinaria Italiana，2012，48（3）：291－296.

［18］ Wang A，Ruch－Gallie R，Scorza V，et al.Prevalence of Giardiaand Cryptosporidiumspecies in dog park attending dogs compared to non－dog park attending dogs in one region of Colorado［J］.Vet Parasitol，2012，184（2－4）：335－340.

［19］ 马利青，王戈平，陆 艳，等.青海省犬隐孢子虫病的血清学检测［J］.中国动物传染病学报，2010，18（4）：65－67.

［20］ 齐 萌，王 强，孙艳茹，等.宠物犬肠道寄生虫调查及其公共卫生意义分析［J］.畜牧与兽医，2010，42（4）：81－83.

［21］ Li L，Pesavento P A，Leutenegger C M，et al.A novel Bocavirus in canine liver［J］.Virol J，2013，10（54）：1－4.

［22］ Rachel M C，Angharad P D.Minireview：Clinical cryptosporidiosis［J］.Exp Parasitol，2010，124（1）：138－146.

［23］ Castro－Hermida J A，Pors I，Méndez－Hermida F，et al.Evaluation of two commercial disinfectants on the viability and infectivity of Cryptosporidium parvum oocysts［J］.Vet J，2006，171（2）：340－345.

［24］ Korich D G，Mead J R，Madore M S，et al.Effects of ozone，chlorine dioxide，chlorine，and monochloramine on Cryptosporidium parvumoocyst viability［J］.Appl Environ Microbiol，1990，56（5）：1423－1428.

［25］ 车 頔，应 超，李秀英，等.补骨脂及双氢青蒿素杀灭隐孢子虫的观察［J］.中国人兽共患病学报，2010，26（4）：360－363.

［26］ 杨 娜，李 凤，程卯生.隐孢子虫病的化学治疗研究进展［J］.沈阳药科大学学报，2011，28（8）：649－657.

［27］ Shahiduzzaman M，Daugschies A.Therapy and prevention of cryptosporidiosis in animals［J］.Vet Parasitol，2012，188（3－4）：203－214.

［28］ Paraud C，Pors I，Journal J P，et al.Control of cryptosporidiosis in neonatal goat kids：Efficacy of a product containing activated charcoal and wood vinegar liquid（Obionekk＠）in field conditions［J］.Vet Parasitol，2011，180（3－4）：354－357.

［29］ Boulter－Bitzer J I，Lee H，Trevors J T.Molecular targets for detection and immunotherapy in Cryptosporidium parvum［J］.Biotechnol Adv，2007，25（1）：13－44.