4种常见呼吸道病毒快速分子检测方法的建立

王 洁，李利平，王卫萍，李晓军

(本文编辑:张仲书; 英文编辑:王建东)

目前已证明，90%以上的急性上呼吸道疾病和大部分的下呼吸道疾病是由细菌以外的病原体引起，其中以呼吸道病毒最常见［1-2］，包括流感病毒A(FluA)、流感病毒 B(FluB)、呼吸道合胞病毒(RSV)A型、B型以及副流感病毒1型、3型等。近年来，新发呼吸道传染病如SARS、禽流感等疾病的爆发，给人类社会和国民经济带来很大负担［3］。由于这些病毒引起的感染症状和流行特点相似，仅靠临床症状及常规检测方法进行病原的确定非常不可靠［4］，因此迫切需要一种高灵敏度和特异性的方法可以同时准确地鉴别诊断和快速识别病原体，对预防疾病的传播和患者的诊断治疗至关重要。

本研究将靶序列富集多重-聚合酶链反应(target enriched multiplex PCR，Tem-PCR)和 Luminex液相芯片(multiple analytes profiling，xMAP)技术有机结合，克服了病毒分离培养、血清学诊断及单一PCR的缺点，可以在单个反应体系中检测出4种常见病毒引起的呼吸道感染。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 pCR○RⅡ载体、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)及脱氧核糖核酸酶I(DnaseⅠ)等购自上海Invotrizen公司，质粒小量提取试剂盒(QIAprep Spin Miniprep Kit)和 cDNA第一链合成试剂盒(Quantscipt RT Kit)购自德国QIAGEN公司，Wizard SV凝胶及PCR纯化系统(Wizard SV Gel and PCR Clean-up System)、ApaⅠ限制性内切酶、SP6 RNA 聚合酶及 rNTP购自 Promega公司，Trans Start TM TaqDNA聚合酶购自北京全式金生物技术公司，RNA磁珠柱提取试剂盒购自上海之江生物科技有限公司，PCR仪购自美国ABI公司，Luminex Liquidchip 200系统及配套耗材购自上海透景生命科技有限公司。

1.2 引物和探针序列的设计及合成 从NCBI下载病毒的靶标核酸序列，利用Primer Premier 5.0软件分析并设计位于保守区内的病毒特异性引物(Fo、Fi、Ro、Ri)和特异杂交探针(De)，其中 Fi引物的3’端和Ri引物的5’端分别加入一段非同源性序列作为通用引物(RSP，FSP)，构成特异性嵌合引物，上、下游通用引物的5’端均标记生物素，最终在与荧光编码微球探针杂交时，与结合有荧光素的链亲和素反应，成为报告信号。所有引物、探针的合成及修饰由上海Invotrizen公司完成(表1)。

1.3 靶标病毒体外转录RNA 为避免在研究过程中接触有致病性危险的真正病原体，需要设计和制备针对每一种病毒检测的靶标RNA。本文研究涉及的4种呼吸道病毒基因组均为RNA，因此根据RNA模板的碱基序列首先人工合成DNA，并将合成的DNA片段克隆到pCR○RⅡ载体中，将重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5a，经PCR、酶切、测序鉴定靶标序列正确后，对质粒进行体外转录和纯化，获得体外转录靶标RNA即IVT-RNA。利用紫外分光光度计测定浓度和纯度，并根据分子量和核酸浓度计算拷贝数。

1.4 Tem-PCR反应 本文作为对方法学的可行性研究和初步表征，采用体外合成的靶标病毒RNA(IVT-RNA)为检测对象，模拟临床标本将其加入咽拭子采集液的裂解液中，磁珠柱法提取RNA并反转录成cDNA进行Tem-PCR反应。反应体系:10×Buffer 2.5 μl，dNTPs(2.5 mM)2 μl，Trans Start TM TaqDNA聚合酶(2.5 U)1 μl，上、下游特异外引物(Fo和 Ro:0.1 μmol/L)各 1 μl，上、下游嵌合引物(Fi和 Ri:0.4 μmol/L)各 1 μl，上游通用引物(FSP:1 μmol/L)1 μl，下游通用引物(RSP:4 μmol/L)1 μl，模板1 μl，去 RNA 酶水补足至25 μl。反应条件:预变性95℃ 15 min;特异和嵌合引物扩增94 ℃30 s、56 ℃ 35 s、72 ℃ 20 s，15 个循环;通用引物扩增93 ℃ 20 s、57 ℃ 25 s、71 ℃ 15 s，35个循环;最后72℃延伸3 min，4℃保存。

1.5 PCR产物杂交和液相芯片检测

1.5.1 探针微球的制备 由上海透景生命科技有限公司制备针对每一种病毒的探针微球，2～8℃避光保存备用。

表1 引物和探针序列

1.5.2 杂交反应和检测 取1.5×四甲基氯化铵溶液(tetramethylammonium chloride solution，TMAC)22μl，加上述制备好的4种探针微球包被液各0.1 μl和PCR产物3μl，95℃变性5 min，48℃杂交59 min，此时加入预热的链霉亲和素稀释液(streptavidin-r-phycoerythrin，SA-PE)75 μl继续反应 15 min。结束后用Luminex Liquidchip 200系统分析结果。

1.6 检测体系特异性验证 为了检查是否针对某种病毒的探针会和其他病毒非特异性结合产生交叉反应信号，在反应体系中加入针对4种病毒的微球探针混合物，但每个反应体系只加一种病毒模板(1 μl，相当于4.5 ×103个拷贝数)，检测每种微球上的信号值。通过比较非目标病毒微球荧光信号值与背景荧光信号值，评估检测系统的特异性。

1.7 检测体系灵敏度实验 体外转录靶标RNA经过紫外分光光度计定量后换算为拷贝数，对其倍比稀释，获100至103的4个浓度梯度的 IVT-RNA。模拟临床标本将其分别加入咽拭子采集液的裂解液中，磁珠柱法提取RNA并反转录成cDNA，各取1μl作为模板，检测灵敏度。实验非同日3次平行进行。

1.8 统计学处理 采用SPSS 11.0软件进行，定量数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 靶标病毒序列验证 将含靶标病毒序列的重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5a，提取质粒送上海Invotrizen公司测序鉴定，经软件比对靶标病毒序列与设计的序列一致，见图1。

2.2 检测体系特异性 一种病毒模板，仅与相应目标微球探针产生特异性荧光信号，与其他微球探针及空白对照检测到的荧光强度值具显著差异(P均＜0.01，表2)。

表2 检测体系的特异性验证结果

2.3 检测体系灵敏度 靶标病毒按不同浓度梯度提取RNA，Tem-PCR检测下限均可达10拷贝/μl(表3)，具有较高的灵敏度。

图1 四种靶标病毒核酸测序峰图

3 讨论

呼吸道病毒是最常见的引起急性呼吸道感染的病原体之一，不仅可以引起多种严重的并发症，其最大的危害是具有潜在引发局部范围甚至世界大流行的可能，是目前人类面临的全球性公共卫生问题［5］。由于这些病毒感染导致的临床症状相似，病原学复杂，并且新的致病性病毒还在不断地被发现，给临床疾病诊断和治疗造成极大的困难，如1997年在香港肆虐的禽流感、2003年SARS的爆发以及2009年甲型H1N1流感在世界范围的流行，均提示及时与准确地快速鉴别病原体，对预防疾病的传播和患者的诊断治疗至关重要。

表3 检测体系灵敏度试验结果(x ± s，n=3)

引起急性呼吸道感染的病毒传统的实验室诊断方法主要有病毒分离、抗原抗体分析及病毒基因检测等，这些方法耗时耗力;针对某些病毒如人鼻病毒、人冠状病毒、副流感病毒等进行细胞分离培养也较困难，还常出现具有典型临床症状和流行病证据但标本检测结果为阴性的情况，不利于早期诊断和疫情的应急处理。另外，由于病毒合并感染现象普遍存在，而在细胞培养中一种病毒复制可能会抑制或掩盖另一种病毒的复制，因此细胞培养方法难以检出标本中可能存在的病毒合并感染，对那些预后较差的合并感染的早期诊断尤为不利［6］。血清学方法快速，在较短的时间内就可以获得检测结果，但它往往需要病毒感染人体一段时间后才能检测，并且需要已知的特定抗原或抗体，而造成呼吸道感染的病毒有几百种，目前市场尚不能满足诊断要求［7-8］。随着微生物基因组计划的进展，许多病毒的基因组序列已被破解，已有用 RT-PCR、real-time PCR、nested-PCR 等［9-13］技术对病毒进行快速诊断的相关报道。但这些方法通常一次只能从标本中检验出一种病毒，在不明确病毒感染的情况下，这无异于大海捞针。虽然有人采用多重PCR方法对几种病毒进行同时检测，但往往因为反应体系中需要添加更多的扩增引物而导致PCR灵敏度和特异性下降，而且每条不同的靶序列都具有各自的最佳扩增条件，很难将其统一。本研究采用独特设计的Tem-PCR扩增技术，利用标准化高通量液相芯片检测系统，实现了4种常见呼吸道病毒基因的快速检测。

该系统采用荧光标记通用引物和特异性嵌合引物相结合建立的多重聚合酶链反应体系，先由特异引物和嵌合引物的特异性序列分别结合到cDNA模板启动PCR反应，数个反应循环后，分别扩增出上下游通用引物的互补序列;反应体系中荧光标记通用引物的浓度是特异引物和嵌合引物浓度的2.5～40倍，占主导地位的荧光标记通用引物与其互补序列结合引发后续指数扩增。液相芯片技术(又称流式荧光技术)是建立在基因芯片技术上的一项在液相体系中完成探针与目的基因杂交新技术，它有机地整合了编码微球、激光技术、应用流体学、数字信号处理器和计算机运用等技术，具有高通量、高速度、低成本、灵敏度高、重复性好、线性范围广等优点［14-16］，通过对颜色编码的微球表面进行化学结构修饰，使之与病毒的特异捕获探针形成特异的共价结合。在杂交悬浮体系中，标记的PCR产物被结合有微球的探针捕获，再经过一套微流体系统检测装置，红色激光激发微球本身的荧光，用于鉴别微球的种类，识别病毒;绿色激光激发报告分子结合的荧光，通过检测荧光的强度对被测物质进行定量分析。

本研究分析了该系统检测4种常见呼吸道病毒的特异性和敏感性，数据表明该检测体系具有很好的特异性和较高的灵敏度(可达10拷贝/μl)，可以灵敏、快速地检测与呼吸道病相关的4种常见呼吸道病毒，以实现临床快速诊断、预防院内感染，为控制大规模疫情暴发提供实验室依据。但本检测体系使用的液相芯片技术比较灵敏，有可能存在污染问题，因此需要对操作进行标准化。另外由于RNA模板容易降解，应避免样本反复冻融造成假阴性结果。最后由于病毒各型保守区核苷酸序列存在不同程度变异，因此该体系还有待于大量临床样本的验证和进一步优化。

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