ERCC1与RRM1在胰腺癌组织中的表达及临床意义

柴文刚 王广义 谢淑丽 王 蒙 (吉林大学第一医院，吉林 长春 130021)

胰腺癌半数以上位于胰头，约90%是起源于腺管上皮的管腺癌(PDA)。核酸剪切修复偶联因子1(ERCC1)定位于19q 13.2，是核苷酸外切修复酶家族中的重要成员之一，是细胞存活必需的DNA修复基因，具有损伤的识别和切除功能，其表达的高低能反映整个DNA切除修复(NER，核酸切除修复)活性的水平〔1〕。RRM1基因主要定位在人类染色体的11q15.5区域。这恰好也是一个多种恶性肿瘤疾病可能出现杂合子丢失现象的区域，其作用主要是为DNA修复提供原料〔2〕。研究显示ERCC1与RRM1与肿瘤的发生、发展及化疗耐受有关〔3〕。目前对两种基因的研究主要集中在非小细胞肺癌中，胰腺研究罕有报道。本实验通过免疫组化方法检测ERCC1及RRM1在PDA中的表达，明确其在PDA中的临床意义。

1 材料与方法

1.1 病例收集及分组 收集吉林大学第一医院2009年1月至2012年6月胰腺癌手术切除标本34例，男性24例(70.6%)，女性10例(29.4%)，年龄22～72岁，平均(55.2±12.8)岁。病理类型均为PDA，其中高分化(中高、高分化)12例(35.3%)，低分化(中、中低、低分化)22例(64.7%);肿瘤直径＜3 cm 18例(52.9%)，≥3 cm 16例(47.1%);发生区域淋巴结转移18例(52.9%)。选取34例患者的癌旁组织(距癌组织≥3 cm)，另收集正常胰腺组织20例。以上标本均经4%甲醛溶液固定后常规石蜡包埋、切片。

1.2 主要试剂 一抗为兔抗人ERCC1、RRM1多克隆抗体，购自北京博奥森生物技术有限公司。稀释液以0.01 mol/L PBS与10 mg/ml BSA与0.1%叠氮Na组成，稀释1∶400。免疫组化染色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。试剂盒组成:A液，内源性过氧化物酶阻断剂;B液，动物非免疫血清(羊);C液，生物素标记的羊抗鼠/兔IgG;D液，链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶。DAB工作液配制:A、B、C液各50 μl按顺序加入到0.85 ml的蒸馏水中，混匀后备用。

1.3 方法 ERCC1和RRM1染色方法均为SABC免疫组化法。细胞质和(或)细胞核内含棕黄色颗粒者为阳性细胞。根据切片中阳性细胞着色程度评分(无着色0分，弱着色1分，中度着色2分，强度着色3分)。ERCC1阳性细胞率评分(＜1%，0分;1% ～9%，1分;10% ～24%，2分;25% ～50%，3分;＞50%，4分)，两评分之积为该病理切片评分值，且将评分值＜3分定为低表达病例，≥3分定为高表达病例。RRM1阳性细胞率评分(＜1%，0分;1% ～9%，1分;10% ～50%，2分;≥50%，3分)，同样以两评分之积为样本评分，≥6分为高表达，＜6分为低表达。阴性对照以0.01 mol/L PBS液(pH7.4)替代一抗作为阴性对照。免疫组化染色结果经两位有经验的病理医生进行双盲观察计数，根据以上评分标准统计最终样本得分。

1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行χ2检验及Fisher精确概率法检验。

2 结果

ERCC1在肿瘤组34例中高表达者14例(41.2%)，其中高分化组高表达6例(50.0%)低分化组高表达83例(36.4%);发生淋巴结转移组高表达6例(33.3%)，无淋巴结转移组高表达8例(50.0%);肿瘤直径≥3 cm组高表达者6例(37.5%)，肿瘤＜30 m组高表达8例(44.4%);癌旁组(n=34)23例(67.6%)高表达;正常胰腺组(n=20)高表达者 14例(70.0%)。RRM1在肿瘤组34例中高表达者10例(29.4%)，其中高分化组高表达4例(33.3%)，低分化组高表达6例(27.3%);发生淋巴结转移组高表达6例(33.3%)，无淋巴结转移组高表达4例(25.0%);肿瘤直径≥3 cm组高表达者4例(25.0%)，肿瘤直径＜3 cm组高表达6例(33.3%)。癌旁组(n=34)18例(52.9%)高表达;正常胰腺组(n=20)高表达者16例(80.0%)，肿瘤组与癌旁组及正常胰腺组比较ERCC1、RRML阳性率有显著性差异(P＜0.05)。肿瘤组肿瘤大小、有无淋巴结转移、高、低分化与ERCC1、RRML阳性率无关(均P＞0.05)。见图1，图2。

图1 免疫组化染色检测ERCC1表达(×200)

图2 免疫组化染色检测RRM1表达(×200)

3 讨论

ERCC1在人类DNA损伤修复中扮演着重要角色，尤其是修复紫外线所致的嘧啶二聚体与铂-DNA加合物中。ERCC1缺乏的细胞会产生修复缺陷。到目前为止，ERCC1与肿瘤的研究发现，在人群中ERCC1低表达者患肿瘤的风险高，如肺癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌等〔4，5〕，但在胰腺中的作用尚未阐明。国内研究显示，在诱导产生胰腺癌的SD大鼠中，胰腺癌组织的ERCC1表达率显著低于非癌胰腺组织〔6〕。国外众多研究结果不一，有人认为ERCC1的高表达是临床预后不良的独立危险因素〔7〕。ERCC1的低表达可能促使该人群易暴露于致癌物质中，导致胰腺癌的发生。当ERCC1与XPD、XPG、XPA等修复基因将DNA链中受损的部分切除后，DNA链上留下的空缺就由RRM1提供的核苷酸来填补。它是RNA合成的前体，参与核糖核苷酸还原成脱氧核糖核酸的过程，为DNA修复的限速酶。RRM1的研究主要集中于非小细胞肺癌中〔5〕，与之相反，在胰腺癌中RRM1的表达低于癌旁组织及正常胰腺组织，进一步证明，胰腺癌的发生可能与自身DNA损伤修复受到抑制或表达缺失有关。

ERCC1与RRM1是化疗药物铂类与吉西他滨耐药的关键基因〔8，9〕。而目前用于临床的一线化疗方案正是基于吉西他滨，如何减少化疗耐受、延长患者的生存时间及复发时间成为目前胰腺癌治疗的热点。根据基因表达的高低，化疗方案个体化，避免耐受药物的使用，可提高敏感性，降低毒副作用。

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2 陈 芹，周彩存，张 颉.ERCC1、RRM1和BRCA1在非小细胞肺癌中的表达及预后意义〔J〕.肿瘤，2007;27(9):719-22.

3 Valsecchi ME，Holdbrook T，Leiby BE，et al.Is there a role for the quantification of RRM1 and ERCC1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma〔J〕?BMC Cancer，2012;12(3):104.

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5 傅建民，周 颉，谢建生，等.乳腺癌新辅助化疗对ERCC1基因表达的影响〔J〕.南方医科大学学报，2008;28(4):603-5.

6 杨竹林，李清龙，邓星辉，等.大鼠胰腺癌和非癌胰腺组织DNA损伤修复蛋白表达及意义〔J〕.医学研究杂志，2009;38(2):60-4.

7 Maithel SK，Coban I，Kneuertz PJ，et al.Differential expression of ERCC1 in pancreas adenocarcinoma:high tumor expression is associated with earlier recurrence and shortened survival after resection〔J〕.Ann Surg Oncol，2011;18(19):2699-705.

8 Jae Jin Lee，Chi Hoon Maeng，Seon Kyung Baekb，et al.The immunohistochemical overexpression of ribonucleotide reductase regulatory subunit M1(RRM1)protein is a predictor of shorter survival to gemcitabinebased chemotherapy in advanced non-small cell lung cancer(NSCLC)〔J〕.Lung Cancer，2010;70(2):205-10.

9 Lee S，Park YH，Kim KH，et al.Thymidine synthase，thymidine phosphorylase，and excision repair cross-complementation group 1 expression as predictive markers of capecitabine plus cisplatin chemotherapy as firstline treatment for patients with advanced oesophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Br J Cancer，2010;103:845-51.