何首乌二苯乙烯苷对大鼠海马神经元L型钙离子通道的影响

朱秋双 任春清 包利泽 赵锦程 刘 蕾 白 雪 杨 玉 刘明远

(佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)

脑组织细胞钙离子内流增加，能启动细胞凋亡通路，是阿尔茨海默病(AD)发病机制之一〔1〕。随着中国不可逆转的进入老龄化社会，AD已经成为影响我国人口健康和生活质量的公共健康问题，开发研究确实有效的预防治疗药物非常迫切。何首乌(Polygonum Multiflorum Thunb)据《本草纲目》记载有“益精髓、延年不老”之效。本课题组前期实验结果表明，何首乌对大鼠的学习记忆有保护作用，且能抑制海马细胞凋亡〔2〕。二苯乙烯苷(TSG)是何首乌的主要有效成分。本研究利用膜片钳技术研究TSG对海马L型钙离子通道的影响，试图从离子通道水平解释何首乌对AD影响的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 健康Wistar大鼠〔购自长春高新医学动物实验研究中心，合格证号:SCXK-(吉)2003-0004)〕，体重200 g左右。

1.2 主要试剂与仪器 NVSLM1型振动切片机(Campden，英国);电极拉制仪(P-97，美国);倒置相差显微镜(Nikon，日本);膜片钳系统(Axon，美国);Pronase E(Sigma公司，美国);Axopatch200-A放大器(Axon InstrumentsCA，美国);Aβ1-40(Sigma公司，美国);TSG(黑龙江省药材公司)。

1.3 溶液 人工脑脊液(ACSF，mmol/L):NaCl 124，KCl 3，CaCl22，MgCl22，NaH2PO41.23，NaHCO326和 Glucose 10;切片液(mmol/L):KCl 2.5，NaH2PO41.25，MgCl26，CaCl21，sucrose 220，NaHCO326，Glucose 10。在电流钳模式下，记录钙电流的电极内液(mmol/L):K2SO460，NMG 60，HEPES 40，MgCl24，BAPTA 0.5，Phosphocreatine 12，Na2ATP 2，Na3GTP 0.2，用KOH将pH值调至7.2。在电压钳模式，记录钙电流的电极内液(mmol/L):KCl 140、MgCl20.5、EGTA 2、HEPES 5、K2ATP;记录电压依赖性钙电流的细胞外液(mmol/L):NaCl 150，KCl 5，MgCl21.1，CaCl22.5，HEPES 10，Glucose 10，TTX 0.001，用NaOH调pH为7.4。

1.4 方法

1.4.1 海马锥体神经元的制备 取200 g左右的Wistar大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射，待麻醉生效后，剪开胸腔，暴露心脏，夹闭下腔静脉，使用0℃切片液进行心脏灌注。待灌流液体颜色较淡结束灌注，断头，取出全脑，置入0℃切片液(提前30 min经95%O2+5%CO2混合气饱和)中冰镇3 min，分离出海马，以350 μm 的厚度进行切片〔3，4〕。将脑片移入 37℃ 水浴槽中待用的ACSF(提前30 h经混合气饱和)中孵育1 h，转入23℃ACSF(经混合气饱和)中继续孵育30 min后将脑片移入含6.0～7.0 U/ml的Pronase E的细胞外液中。32℃酶解25 min后用细胞外液清洗脑片6次以上，然后移入室温细胞外液孵育备用。在整个过程中持续通氧气。取脑片分离出CA1区，移入盛有氧饱和的细胞外液的离心管内，用滴管轻轻吹打，将离心管竖直静置，吸取上部细胞悬液，加入含有细胞外液的灌流槽中。约30 min后细胞贴壁，即可进行全细胞膜片钳实验。

1.4.2 全细胞膜片钳电生理记录TSG对海马L型钙离子通道(ICa-L)的影响 将新鲜分离的海马神经元放置于倒置显微镜上的灌流槽中，在室温(23℃)下应用全细胞膜片钳技术记录单细胞离子电流。记录电极经P97微电极拉制仪拉制，尖端直径1～2 μm，充灌电极内液后电阻 2～4 MΩ，电极内液使用0.2 μm的微孔滤膜滤过后充灌电极。采用传统的全细胞膜片钳技术记录，抽吸破膜即可形成全细胞记录。记录电压依赖性钙电流采用阶梯波给予刺激，钳制电压设置为－80 mV，持续50 ms;去极化到－40 mV，持续200 ms使钠电流失活，超极化到－45 mV，10 ms后再去极化达到测试电压0 mV，持续200 ms，频率为0.2 Hz。记录I-V曲线时钳制电压为－40 mV，以10 mV的步阶脉冲去极化至+40 mV，持续200 ms。实验过程由计算机软件pCLAMP9.2(Axon Instrument)控制数-模转换器完成刺激信号的产生、反馈信号的采集以及数据分析。

分别以2.0和6.0 μmol/L TSG灌流给药，观察不同浓度的TSG对神经元 ICa-L的影响。使用 Aβ1～40后分别使用2.0和6.0 μmol/L TSG观察不同浓度的 TSG对 L型钙电流/电压(I-V)曲线的影响。实验信号采集频率:10 kHz。滤波频率:2 kHz。

2 结果

2.1 TSG对ICa-L的影响 采用保持电位－40 mV，指令电压－40至+60 mV，钳制时间200 ms，阶跃10 mV的刺激程序引出ICa-L，并且记录30 min内“rundown”现象，得出在12 min内衰减明显，所有的电流记录均在电流稳定后进行。灌流给药2.0及6.0 μmol/L TSG后5 min药效稳定。结果显示不同浓度的TSG对神经元ICa-L的影响不具有统计学差异。见表1。

表1 不同浓度的TSG对ICa-L的影响(± s，n=10)

表1 不同浓度的TSG对ICa-L的影响(± s，n=10)

组别 给药前 给药后 P值2.0 μmol/L 16.75±0.83 15.25±1.03 ＞0.05 6.0 μmol/L 17.02±0.69 16.38±1.15 ＞0.05

2.2 TSG对ICa-L/电压(I-V)曲线的影响 在电压钳方式下保持电位－40 mV，施予200 ms，阶跃10 mV，－40至+60 mV的系列去极化脉冲，可引出ICa-L。细胞外给予1 μmol/L的Aβ，待稳定以后，再给予2.0、6.0 μmol/L的 TSG，增大的 ICa-L峰值分别降低(37.27±3.65)%、(70.09±1.97)%，以各脉冲下电流密度(pA/pF)幅值对相应测试电压作图得I-V曲线，将各细胞给药前后I-V曲线的最大激活电压进行统计分析。结果正常对照组细胞的最大激活电压为0 mV，给药后各测试电压水平ICa-L减小，I-V曲线上移，不具有统计学差异。见图1。

图1 不同浓度TSG对I-V曲线的影响

3 讨论

AD是在老年人衰老退化基础上发生的痴呆，其病因及发病机制目前尚不十分清楚。目前认为神经毒性物质Aβ在脑中广泛沉积在原发性痴呆发病中起中心作用，能引发神经元退化和凋亡等诸多病理过程，最后引起痴呆〔5〕。海马锥体神经元是海马区的主要成分，主要功能是参与近期记忆、情绪及内脏功能调节，是老年性痴呆、癫痫等疾病的主要病灶之一。本课题研究小组实验研究表明何首乌硫浸膏对Aβ1～40注入大鼠右侧海马致AD模型小鼠的分辨学习及记忆保持能力有极大提高，对海马细胞有保护作用，其具体机制不明确。是否对脑细胞离子通道有影响鲜有报道。

何首乌含有二苯乙烯苷、蒽醌类、磷脂类、糖类、多种氨基酸、多种维生素及微量元素，具有降血脂、抗衰老、增强免疫功能等作用〔6〕。TSG是何首乌降血脂的主要有效成分。《中国药典》2005年版一部规定何首乌药材中TSG不得少于1.0%。海马神经元上分布有L-型、T-型、N-型等多种钙离子通道，其中L型电压门控钙通道广泛分布于中枢神经系统，参与钙稳态、突触可塑性、基因表达、激素分泌等多种细胞功能的调控，其过度激活与神经退行性疾病、脑缺血、脑肿瘤等的病理过程有着密切的关系。本研究利用膜片钳技术研究不同浓度TSG对未处理以及Aβ预处理的海马神经元的ICa-L的影响，结果显示不具有统计学差异，提示TSG对海马神经元的ICa-L通道不具有影响作用。

淀粉样蛋白级联假说一直占有AD发病机制的主要地位，Arispe在海马神经元细胞中加入Aβ观察〔Ca2+〕i变化，结果大部分细胞〔Ca2+〕i都有明显提高，而且 Aβ浓度增大，〔Ca2+〕i提高越多，呈现一定的浓度依赖性。钙通道阻断剂的存在并不影响Aβ引发的〔Ca2+〕i升高，而Aβ抗体能显著降低Aβ引发的〔Ca2+〕i升高，说明〔Ca2+〕i的升高不是通过钙通道流入的，而是通过 Aβ在膜上形成的通道进入细胞，引起〔Ca2+〕i超载〔7〕。因此，何首乌及其有效成分对AD的作用及机制，何首乌中有效成分TSG影响海马细胞内离子浓度方面的作用有待进一步研究。

1 赵保路，万 莉.金属离子代谢平衡失调与阿尔茨海默病早期发病机制〔J〕.生物化学与生物物理进展，2012;39(8):756-63.

2 朱秋双，任春清，包利泽，等.何首乌对阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力的作用〔J〕.黑龙江医药科学，2011;34(3):8.

3 Huang CS，Shi SH，Ule J，et al.Common molecular pathways mediate long-term potentiation of synaptic excitation and slow synaptic inhibition〔J〕.Cell，2005;123(1):105-18.

4 Xu ZC，Chen HSH.Preliminary study of application of patch clamp technique in adult rat hippocampal slices〔J〕.J Chongqing Med Univ，2012;37(9):799-801.

5 Giovannel L，Gasamenti F，Scall C，et al.Differential effect of amyloid peptide Aβ1-40 injection into the rat nucleus basalis〔J〕.Neuroscience，1995;66(6):781-2.

6 姚桂根，孙小萍，邓星航.用醋酸镁-甲醇比色法测定何首乌及其制剂中蒽醌类成分的含量〔J〕.中草药，1983;14(6):8-15.

7 Arispe N，Rojas E，Pollard HB.Giant multilevel cation channels formed by Alzheimer disease amyloid beta-protein A beta(1-40)in bilayer membranes〔J〕.Proc Natl Acad Sic USA，1993;90(5):567-71.