Gadd45a在人脑胶质瘤细胞中的表达及其与细胞凋亡及增殖的关系

2013-09-21 12:59冀秀英王艳梅梁丽梅吉林省精神神经病医院吉林四平6000
中国老年学杂志 2013年7期
关键词:人脑神经细胞悬液

冀秀英 王艳梅 白 洋 梁丽梅 (吉林省精神神经病医院,吉林 四平 6000)

脑胶质瘤是由于大脑和脊髓胶质细胞癌变所产生的、最常见的原发性颅脑肿瘤。如同其他肿瘤(疾病)一样,胶质瘤也是由于先天的遗传高危因素和环境的致癌因素相互作用所导致的。Gadd45a细胞受到辐射等外界因素刺激DNA受到损伤后而表达的基因,Gadd45a基因高表达后可以通过阻滞细胞周期在G2-M期、修复DNA、促进细胞凋亡等保留大部分细胞的存活,而减少细胞癌变的可能。目前研究表明,Gadd45a基因异常表达与乳腺癌、胰腺癌、肺癌及前列腺癌密切相关〔1~5〕。本文探讨Gadd45a在人脑胶质瘤细胞中的表达及其与细胞凋亡及增殖的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 胶质瘤细胞系U251细胞购自上海科兴生物科技有限公司;正常脑组织来自我院神经外科手术切除组织;胎牛血清、annexinⅤ、PI、MTT试剂购自 Hyclone公司;M-MLV逆转录酶购自Promega公司;流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 脑组织制备单细胞悬液的方法 将大脑组织置于事先消毒好的200目细胞筛(下接容器),用玻璃棒轻轻研磨脑组织,使其变成单个细胞,待研碎后用生理盐水或培养液冲洗,细胞筛下容器内所盛溶液为单细胞悬液。用吸管吹打均匀后离心,1 000 r/min,5 min,倾出上清,如此冲洗1~2次后加生理盐水或培养液,制成单个脑细胞悬液,用于实验。

1.2.2 RT-PCR方法检测Gadd45a mRNA在细胞中的表达根据RT-PCR试剂盒说明书,提取正常脑组织神经细胞和U251细胞中的总RNA进行PCR反应。选择GAPDH作为内参照。Gadd45a上游引物:5'TTACATTGGCAAGTT3',下游引物:5'C GCGCCGAATTCAT3',342 bp;GAPDH 上游引物:5'GGATTCGCCATTACT3',下游引物:5'AGGATTAGCTT3',520 bp。PCR 产物经2%琼脂糖凝胶电泳(含0.15 g/L溴乙啶)分离后,用DEL2000凝胶成像分析系统拍照分析。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率 将正常脑组织神经细胞和U251细胞在6孔板内培养,接种密度4×105ml-1,培养至细胞汇合后,PBS液清洗经消化收集的细胞2~3次,调整细胞密度为1×106ml-1,将细胞悬液100 μl转移至试管中;加入FITC标记的annexinⅤ和PI溶液,轻轻混匀;室温避光放置10~15 min;加入400 μl缓冲液,将全部液体转移至FCM分析用试管,用FCM进行细胞周期分析,采用Becton Dickinson公司的Cell Fit进行自动分析,统计细胞周期各个时相所占比例及凋亡情况。

1.2.4 MTT法检测细胞增殖情况 单细胞悬液接种于96孔培养板;103~104细胞/孔,每孔培养基总量200 μl(96孔培养板每孔容积370 μl),37℃、5%CO2培养箱中培养 24 h,加入2 mg/ml MTT液(50 μl/孔);继续培养3 h。吸出孔内培养液后,加入DMSO液(150 μl/孔),将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10 min,使结晶物溶解。酶标仪检测各孔OD值(检测波长570 nm)。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行组间t检验。

2 结果

2.1 各组细胞Gadd45a mRNA表达 正常人脑组织神经细胞中的Gadd45a mRNA表达水平明显高于U251细胞Gadd45a mRNA表达水平(P<0.05)。见图1。

2.2 各组细胞的细胞周期比例 U251细胞在S期比例明显高于正常人脑神经细胞,G2~M期细胞比率明显降低正常人脑神经细胞(P<0.05)。见表1。

图1 各组细胞Gadd45a mRNA表达

表1 各组细胞的细胞周期比例(n=5,%,±s)

表1 各组细胞的细胞周期比例(n=5,%,±s)

与正常脑神经细胞比较:1)P<0.05

组别 G0~G1期 S期 G2~M期正常脑神经细胞42.21±2.67 45.94±2.91 11.85±1.55 U251细胞 27.32±2.23 70.95±2.441) 1.73±0.971)

2.3 各组细胞凋亡率 U251细胞凋亡率(17.81%±1.65%)明显低于正常人脑神经细胞(43.74% ±2.32%,P<0.05)。

2.4 各组细胞增殖情况 U251细胞增殖率(77.12%±2.37%)明显高于正常人脑神经细胞(21.74% ±1.21%,P<0.05)。

3 讨论

肿瘤是机体在各种因素作用下,局部组织的细胞在基因水平上失去了对其生长的正常调控,导致细胞的异常增生而形成的新生物。肿瘤是基因疾病,其生物学基础是基因的异常。致瘤因素使体细胞基因突变,导致正常基因失常,基因表达紊乱,从而影响细胞的生物学活性与遗传特性,形成了与正常细胞在形态、代谢与功能上均有所不同的肿瘤细胞。肿瘤的发生是多基因、多步骤突变的结果。不同的基因的突变与不同强度的突变形成了不同的肿瘤。Gadd45基因是生长抑制及DNA损伤诱导基因家族中的一员,是电离辐射效应基因之一,在细胞周期调控、DNA损伤修复及细胞凋亡过程中发挥重要作用,这使它成为维持基因组稳定性的重要基因,在肿瘤细胞存活、凋亡信号通路中发挥错综复杂的作用,从而参与肿瘤的发生和发展。研究显示Gadd45a介导的生长抑制与Gadd45a对细胞周期G2~M期监测点和细胞凋亡的调控密切相关〔6〕。研究表明,Gadd45a进入细胞核内后与细胞周期分裂相关基因2(Cdc2)结合,形成Gadd45a/Cdc2复合体,由于此复合体不具有细胞周期依赖性激酶的作用,因此细胞无法由G2期进入M期,从而导致细胞停滞在G2~M期〔7〕。同时有研究结果显示,在Gadd45a基因敲除的上皮细胞,在紫外线辐射后,细胞凋亡受到抑制,提示,Gadd45a可以促进细胞凋亡〔8〕。本文结果显示,Gadd45a基因在脑胶质瘤细胞中的表达明显下调,同时伴随脑胶质瘤细胞周期停滞在G2~M期,细胞凋亡率明显下降,增殖能力增强,与上述结果一致,证实Gadd45a基因作为机体的保护性基因,其表达缺失或下降,直接参与脑胶质瘤的发生与发展。因此,针对Gadd45a基因的靶向性研究可以成为脑胶质瘤治疗学方面的重点。

1 Yamasawa K,Nio Y,Dong M,et al.Clinicopathological significance of abnormalitics in Gadd 45 expression and its regulationship to p53 in human pancreatic cancer〔J〕.Clin Cancer Res,2002;8(8):2563-9.

2 Tront JS,Hoffman B,Liebermann DA.Gadd45a alpha is highly expressed in pancreatic ductal adenocarcinoma cells and required for tumor cell viability〔J〕.Int J Cancer,2006;118(10):2405-11.

3 Sensi E,Tancredi M,Aretini P,et al.Clinicalpathological significance of GADD45 gene alternations in human familial breast carcinoma〔J〕.Breast Cancer Res Treat,2004;87(2):197-201.

4 Wang W,Huper G,Guo Y,et al.Analysis of methylation sensitive transcriptome identifies Gadd45a as a frequently methylated gene in breast cancer〔J〕.Oncogene,2005;24(16):2705-14.

5 Oki T,Sowa Y,Hirose T,et al.Genistein induces Gadd45 gene and G2/M cell cycle arrest in the DU145 human prostate cancer cell line〔J〕.FEBS Lett,2004;577(1-2):55-9.

6 姬峻芳,吴 旻,詹启敏,等.Gadd45a在抑制细胞转化和肿瘤恶性进展中的作用〔J〕.生物化学与生物物理进展,2006;33(12):1146-53.

7 Gao H,Jin S,Song Y,et al.B23 regulates GADD45a nuclear translocation and contributes to Gadd45a-induced cell cycle G2-M arrest〔J〕.J Biol Chem,2005;280(12):10988-96.

8 Higashi H,Vallbohmer D,Warnecke-Eberz U,et al.Down-regulation of Gadd45 expression is tumor differentiation in non-small cell lung cancer〔J〕.Anticancer Res,2006;26(3A):2143-7.

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