饲粮精粗比和添加硫胺素对奶牛体外瘤胃发酵参数及菌群结构的影响

潘晓花 王梦芝 付 聪 王洪荣

(扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009)

在当前集约化饲养模式下，为了提高动物的生产效率而大量饲喂以淀粉为主要能源的高精料饲粮，使得亚急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis，SARA)等代谢性疾病的发病率升高，而防治瘤胃酸中毒的传统措施主要是控制饲粮中淀粉等精料的比例或添加碳酸氢钠等碱类物质[1]，以及添加莫能菌素等抗生素以抑制瘤胃微生物产乳酸[2]，但碳酸氢钠只能暂时缓解酸中毒，而很多抗生素会抑制纤维降解菌对粗饲料的降解并存在安全问题，这使得抗生素逐渐被禁用，因此寻求一种安全高效的缓解瘤胃酸中毒的途径具有重要意义。最新的一些研究表明:瘤胃微生物硫胺素代谢与瘤胃酸中毒有密切关系，向高精料饲粮中添加硫胺素能提高瘤胃液pH，降低乳酸、组胺及内毒素浓度，以缓解瘤胃酸中毒[3-5]。而瘤胃酸中毒得以缓解的根本原因是瘤胃微生物中乳酸利用菌和乳酸产生菌的比例逐渐恢复平衡，但有关硫胺素调控瘤胃菌群结构的研究鲜见报道。因此，本试验旨在采用人工瘤胃法研究不同精粗比饲粮对硫胺素微生物净合成量的影响，以及添加硫胺素对体外瘤胃发酵参数和菌群结构的影响，以期揭示硫胺素缓解亚急性瘤胃酸中毒的根本原因，为硫胺素在反刍动物中的实际应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与饲粮

为了减少体外直接诱导亚急性瘤胃酸中毒及体内饲粮因素造成的影响，本试验采用体内初步诱导奶牛发生亚急性瘤胃酸中毒与体外培养相结合的研究方法。试验选用3头安装永久性瘤胃瘘管、体重为(650±20)kg、平均日产奶量为(16.5±0.5)kg、身体健康状况良好的4岁龄荷斯坦奶牛。每天于06:00和18:00按奶牛体重2%的干物质量等量饲喂，自由饮水。试验分为4期，每期饲喂 10 d，依次饲喂精粗比为 40∶60、50∶50、60∶40、70∶30 的试验饲粮，经测定发现第 4期饲喂结束后亚急性瘤胃酸中毒诱导成功。试验饲粮组成及营养水平见表1。

1.2 体外培养试验方法

1.2.1 体外发酵装置

参照Menke等[6]的方法安装人工瘤胃装置，由恒温振荡水浴锅和具3孔(进气口、出气口及采样通道)橡皮塞的250 mL三角烧瓶组成。三角烧瓶用橡皮塞塞好后，调节气体流量，使其在39℃条件下培养。

表1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) %

1.2.2 体外发酵液

于第4期结束后次日晨饲前采集瘤胃液用于体外培养。在晨饲前，利用自制真空负压装置，通过奶牛瘤胃瘘管从3头奶牛瘤胃内各采取250 mL的瘤胃液，经4层纱布过滤，将滤液装于事先通有CO2的灭菌生理盐水瓶中，混合均匀，于39℃水浴保温。

人工唾液盐参照Menke等[6]的方法于使用的前1天配制，按照2∶1的比例将人工唾液盐和瘤胃液混合制备体外发酵液。

1.2.3 体外发酵底物

将粉碎的滤纸纤维素、羧甲基纤维素、果胶、木聚糖、小麦淀粉和可溶性淀粉按表2所列比例配制成精粗比分别为 40∶60、50∶50、60∶40 和 70∶30的4种半纯合饲粮，作为4个时期体外培养的底物，底物添加量为2 g。

表2 体外培养底物的组成Table2 Composition of substrates used for culture in vitro %

1.2.4 试验设计

根据本课题组前期硫胺素添加水平和体外培养的试验结果[5]，确定硫胺素的最佳添加量为180 mg/kg。试验采用2×4因子完全随机试验设计，因素1为硫胺素添加水平，设0和180 mg/kg 2个水平;因素2为底物精粗比，设4个水平，分别为 40∶60、50∶50、60∶40、70∶30。试验共设 8 个处理，每个处理 3个重复，于体外培养 0、3、6、9和12 h后采集培养液用于各指标的测定。

1.3 指标测定与方法

1.3.1 培养液中硫胺素微生物净合成量的测定

参照董淑红[7]的方法，采用荧光分光光度法测定未添加硫胺素时不同精粗比饲粮条件下各采样时间点(0、3、6、9、12 h)培养液中硫胺素的含量，3、6、9、12 h 时培养液中硫胺素的微生物净合成量表示为相对于0 h的增加量。

1.3.2 瘤胃发酵参数的测定

培养液pH的测定采用雷磁pHS-3C型pH计于采样后立即测定，培养液中乳酸浓度的测定参照文献[8]的方法。

1.3.3 瘤胃菌群结构的测定

对体外培养9 h的培养液中的细菌进行定量。瘤胃细菌基因组DNA的提取采用反复冻融法，参照Zhou等[9]的方法进行;瘤胃细菌定量采用PCR标准曲线法，引物序列见表3。PCR反应体系(20 μL)如下:10 μmol/L 的 上、下游引物各0.8 μL，2 × SYBR Green Ⅱ 10 μL，ROX Ⅱ0.4 μL，模板 (50 ng/μL)2 μL，加无菌水至20 μL。PCR反应参数参照 TaKaRa试 剂 盒(DR081A，TaKaRa)说明书进行。参照吕莉华等[10]的方法构建质粒，用以验证扩增片段的准确性并建立标准曲线。

1.4 数据处理

试验数据用Excel 2003建立数据库，通过SAS 9.1.3软件中的ANOVA模块进行单因素及两因素方差分析，运用Duncan氏法进行多重比较，P＜0.05为差异显著，结果以平均值±标准差或平均值与平均标准误表示。

2 结果

2.1 饲粮精粗比对培养液中硫胺素微生物净合成量的影响

由表4可知，随着培养时间的延长，硫胺素的微生物净合成量呈先降低后升高的趋势，精粗比为40∶60和50∶50的饲粮组在培养至6 h时其硫胺素微生物净合成量降至最低，精粗比为60∶40和70∶30的饲粮组在培养至9 h时其硫胺素微生物净合成量降至最低。随着饲粮精料水平的增加，硫胺素的微生物净合成量呈现先升高后降低的趋势，在 3、6、12 h 时常规饲粮(精粗比为 40∶60)组和高精料饲粮(精粗比为70∶30)组差异不显著(P＞0.05)，但上述 2组在 3、9、12 h时均显著或极显著低于精粗比为50∶50和60∶40的饲粮组(P＜0.05或P＜0.01)。此外，高精料饲粮(精粗比为70∶30)组硫胺素的微生物净合成量在9 h时达到最低，极显著低于其他各组(P＜0.01)，并且相对于其0 h时的增加量为-0.037 μg/mL。

表3 瘤胃细菌PCR的引物序列Table3 Primer sequences for PCR of rumen bacteria

表4 饲粮精粗比对培养液中硫胺素微生物净合成量的影响Table4 Effects of dietary concentrate to roughage ratio on microbial net synthetic quantity of thiamine in culture solution μg/mL

2.2 饲粮精粗比和添加硫胺素对奶牛体外瘤胃发酵参数的影响

2.2.1 饲粮精粗比和添加硫胺素对培养液pH的影响

由表5可知，培养液pH与底物的精粗比有着密切的关系，除精粗比为50∶50的饲粮组与精粗比为40∶60的饲粮组在3、6、9 h时未达显著差异(P＞0.05)外，各时间点培养液pH均随饲粮精料水平的增加而极显著降低(P＜0.01)，其中精粗比为70∶30的饲粮组在6、9、12 h时的培养液 pH均低于5.70，达到轻度亚急性瘤胃酸中毒状态[12]。在体外培养3～12 h的时间段内，饲粮中添加硫胺素可极显著提高培养液pH(P＜0.01)。此外，各组培养液pH均随着培养时间的延长而降低。

表5 饲粮精粗比和添加硫胺素对培养液pH的影响Table5 Effects of dietary concentrate to forage ratio and thiamine supplementation on pH in culture solution

2.2.2 饲粮精粗比和添加硫胺素对培养液中乳酸浓度的影响

由表6可知，随着培养时间的增加，各组培养液中乳酸浓度均呈先上升后降低，至12 h时又有所升高的趋势。在3 h时，精粗比为70∶30的饲粮组培养液中乳酸浓度极显著高于其他3组(P＜0.01);在 6 ～12 h时，精粗比为 60∶40 和 70∶30 的饲粮组培养液中乳酸浓度均极显著高于精粗比为40∶60的饲粮组(P ＜0.01)。在 3、9 h时，饲粮添加硫胺素可极显著降低培养液中乳酸浓度(P＜0.01)，但在其他时间点饲粮添加硫胺素对培养液中乳酸浓度的影响差异不显著(P＞0.05)。

2.3 饲粮精粗比和添加硫胺素对奶牛体外瘤胃菌群结构的影响

2.3.1 瘤胃菌群的常规PCR扩增

以提取的细菌基因组DNA为模板扩增各目标片段，用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，牛链球菌、溶纤维丁酸弧菌、埃氏巨型球菌、反刍兽新月单胞菌、乳酸杆菌目标片段常规PCR扩增结果见图1。由图知，每种引物实际扩增片段大小与预期的目的片段大小相符。将这5种PCR产物回收、克隆、构建重组质粒测定，并对阳性克隆测定，测序结果与GenBank Blast进行序列同源性分析，与标准菌株相似性均在95%以上，克隆的片段含有完整的引物对序列，说明质粒构建成功，可以用于制作标准曲线。

表6 饲粮精粗比和添加硫胺素对培养液中乳酸浓度的影响Table6 Effects of dietary concentrate to forage ratio and thiamine supplementation on lactate concentration in culture solution mg/L

2.3.2 质粒标准曲线

由ABI7500实时荧光定量PCR仪的软件自动生成质粒标准品扩增反应曲线。绘制出的荧光定量PCR标准曲线方程分别为:牛链球菌，Y=-3.05X+36.25，R2=0.996;溶纤维丁酸弧菌，Y=-3.35X+36.77，R2=0.985;埃氏巨型球菌，Y=-2.99X+42.51，R2=0.930;反刍兽新月单胞菌，Y=-2.93X+36.25，R2=0.993;乳酸杆菌，Y=-3.18X+37.45，R2=0.987。其中X表示拷贝数的对数，Y表示Ct值。5对引物的扩增效率均在0.9～1.2的范围内，所建立的标准曲线符合PCR定量的要求。

2.3.3 PCR定量分析饲粮精粗比和添加硫胺素对瘤胃菌群结构的影响

由表7可知，随着底物精料水平的增加，培养液中牛链球菌和乳酸杆菌的数量呈增加趋势，而培养液中埃氏巨型球菌的数量则呈先升高后降低的变化趋势。其中，精粗比为60∶40和70∶30的饲粮组培养液中牛链球菌和乳酸杆菌的数量极显著高于精粗比为40∶60和50∶50的饲粮组(P＜0.01);精粗比为50∶50和60∶40的饲粮组培养液中埃氏巨型球菌的数量极显著高于精粗比为40∶60和70∶30的饲粮组(P＜0.01)。饲粮精粗比对培养液中溶纤维丁酸弧菌和反刍兽新月形单胞菌的数量未产生显著影响(P＞0.05)。添加硫胺素可极显著地降低培养液中牛链球菌的数量(P＜0.01)，并极显著地提高埃氏巨型球菌的数量(P＜0.01)，但对乳酸杆菌、溶纤维丁酸弧菌和反刍兽新月单胞菌的数量未产生显著影响(P＞0.05)。

图1 瘤胃细菌16S rDNA目标片段扩增结果Fig.1 Amplification results of target segment of rumen bacteria 16S rDNA

3 讨论

3.1 饲粮精粗比对培养液中硫胺素微生物净合成量的影响

硫胺素主要通过其活性物质焦磷酸硫胺素(TPP)的形式发挥其生理功能。TPP是丙酮酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶复合体和转酮醇酶的辅酶，参与糖酵解、柠檬酸循环和磷酸戊糖途径的非氧化分支[13]。在正常饲喂条件下，反刍动物瘤胃内微生物合成的硫胺素能够满足动物的需要[14-15]，但在高精料饲喂条件下或特殊的生理状态下，反刍动物有可能缺乏硫胺素[16]。Abbas等[17]研究了骆驼不同生理时期血液中硫胺素含量的变化，发现非泌乳期、非妊娠期的骆驼血液内硫胺素含量显著高于其他生理阶段，泌乳期血液硫胺素含量显著降低。硫胺素的缺乏会降低转酮醇酶活性，增加红细胞中TPP水平，当TPP水平增量超过45%时就可能与硫胺素缺乏有关[18]。Karapinar等[19]通过测定奶牛血液中TPP水平以研究在高精料饲喂条件下奶牛是否缺乏硫胺素，结果发现高精料饲喂组血液中TPP水平显著高于对照组(47.2%vs.19.53%)，这说明在高精料饲喂条件下奶牛缺乏硫胺素。本试验研究发现，在精粗比为70∶30的高精料饲喂条件下硫胺素的微生物净合成量显著降低，但与精粗比为40∶60的常规饲粮相比，精粗比在50∶50和60∶40条件下硫胺素的微生物净合成量又显著升高，其原因可能是精粗比为40∶60的常规饲粮的能量水平相对较低，适当的提高精料水平可促进瘤胃微生物合成硫胺素[20-21];但在精粗比为70∶30的高精料饲喂条件下，碳水化合物代谢所需的硫胺素增加，同时由于pH的降低导致瘤胃菌群结构失衡，致使分解硫胺素的硫胺素酶合成量增加[22-24]，使得硫胺素降解量增加。此外，硫胺素的合成量与短链脂肪酸和丙酸的含量呈正相关[25]，而主要的丙酸产生菌是反刍兽新月单胞菌和埃氏巨型球菌，结合本研究中饲粮精粗比对埃氏巨型球菌数量的影响结果可知，精粗比为50∶50、60∶40的饲粮组其埃氏巨型球菌的数量显著高于其他2组，由此推测埃氏巨型球菌数量的增加促进了硫胺素的合成，而在精粗比为70∶30的高精料组由于培养液pH的改变降低了埃氏巨型球菌数量，致使硫胺素的微生物合成量下降。因此，高精料饲喂条件下，反刍动物体内会缺乏硫胺素，而当硫胺素缺乏时，碳水化合物代谢受阻，导致瘤胃乳酸积累，pH下降，最终发生亚急性瘤胃酸中毒或急性瘤胃酸中毒。

3.2 饲粮精粗比和添加硫胺素对奶牛体外瘤胃发酵参数的影响

3.2.1 饲粮精粗比和添加硫胺素对培养液pH的影响

瘤胃液pH是反映瘤胃发酵状况的指标之一，主要受瘤胃上皮对挥发性脂肪酸吸收、食糜外流以及唾液分泌量的影响。由于本试验采用的是体外批次培养法，没有瘤胃对挥发性脂肪酸的吸收和底物的外流，人工唾液盐的缓冲能力也会随时间的延长而降低，导致饲粮中碳水化合物发酵产物大量积累，使得各组培养液pH整体上呈不断下降趋势，但在3 h时，精粗比为40∶60 和50∶50 饲粮组的pH有所升高，原因可能是体外精料水平的降低使得瘤胃发酵速度减慢。在本试验中，高精料饲粮(精粗比为70∶30)组在3～12 h时间内培养液的pH均显著低于常规饲粮(精粗比为40∶60)组，究其原因可能是由于高精料饲粮组培养底物中有较高的可溶性碳水化合物，其在瘤胃中发酵速度较快，从而使微生物产生挥发性脂肪酸和其他有机酸的速度加快，而pH的降低又进一步促使酸利用菌与酸产生菌间的数量失衡，致使pH进一步降低。

表7 饲粮精粗比和添加硫胺素对瘤胃菌群结构的影响Table7 Effects of dietary concentrate to forage ratio and thiamine supplementation on structure of rumen microbial community lg(拷贝数/μL)

本试验结果表明，向各饲粮中添加硫胺素均能有效地提高培养液的pH，这与大多数的研究结果一致[3，26]。结合本试验其他指标测定结果分析，pH的升高可能是由于硫胺素促进了埃氏巨型球菌和反刍兽新月单胞菌的生长，从而促进乳酸的分解，同时硫胺素抑制了牛链球菌的增殖而减少了乳酸的生成量，致使乳酸浓度降低。

3.2.2 饲粮精粗比和添加硫胺素对培养液乳酸浓度的影响

乳酸是碳水化合物代谢的中间产物，由丙酮酸还原而成，瘤胃内产生的乳酸被乳酸利用菌转化为挥发性脂肪酸，为反刍动物提供能量。但长时间饲喂反刍动物高精料饲粮时，瘤胃的消化功能会发生紊乱，乳酸产生菌与乳酸利用菌的平衡被打破，瘤胃内积蓄的乳酸就会异常升高，将会导致瘤胃酸中毒[27]。因此，降低乳酸的浓度对于维持瘤胃内环境的稳定和防止瘤胃酸中毒非常重要。张红伟等[3]以高精料为发酵底物，体外培养12 h后发现添加硫胺素60、90 mg/kg的试验组的乳酸浓度较对照组分别下降42.2%、33.7%。本试验研究也发现，随着精料水平的提高，培养液中乳酸浓度上升，添加硫胺素可显著降低培养液乳酸浓度，其可能原因是精料中易发酵碳水化合物含量较高，瘤胃中硫胺素的微生物合成量难以满足碳水化合物代谢的需要，导致碳水化合物代谢受阻，乳酸浓度升高;另外，因饲粮中添加硫胺素可提高瘤胃pH以缓解瘤胃的酸性环境，并逐渐恢复乳酸产生菌与乳酸利用菌的平衡，使得硫胺素的增加量要大于硫胺素的减少量，从而满足了能量代谢的需要，使碳水化合物的降解顺利进行，减少乳酸的积累[4]。

3.3 饲粮精粗比和添加硫胺素对奶牛体外瘤胃菌群结构的影响

瘤胃内产生的乳酸菌主要包括牛链球菌、淀粉分解菌(溶纤维丁酸弧菌)和乳酸杆菌。牛链球菌具有很强的利用淀粉产生乳酸的能力[28]。通常，当突然饲喂动物含高淀粉的精料饲料时易发生亚急性瘤胃酸中毒和pH的降低，致使牛链球菌大量快速增殖[29]，当 pH低于5.75时，该菌体内1，6-二磷酸激酶(FDP)、磷酸丙糖和丙酮酸浓度增加，乳酸脱氢酶(LDH)被激活，促使代谢终产物乳酸大量积累[30]。本研究结果表明，随着精料水平的提高，牛链球菌和乳酸杆菌的数量逐渐提高，在不添加硫胺素的情况下，70%精料水平组与40%精料水平组相比分别提高了6.31%和5.29%，这与其他研究结果相似[31-33]，但对溶纤维丁酸弧菌的数量无显著性影响，这与赵培厅等[34]的结果相反，原因可能是溶纤维丁酸弧菌是一种严格厌氧型革兰氏阳性菌，而本试验采用体外批次培养法，其生长活性受到抑制。同时，添加硫胺素可极显著降低牛链球菌的数量，但对乳酸杆菌和溶纤维丁酸弧菌的数量无显著影响，该结果与王洪荣等[4]的研究结果一致，说明硫胺素在一定程度上能够抑制牛链球菌的增殖。结合本试验中硫胺素对乳酸浓度和pH影响的试验结果，出现上述结果的原因可能是硫胺素的添加促进了碳水化合物的代谢，减少了丙酮酸的积累，使得乳酸脱氢酶活性降低，从而降低了乳酸的浓度，进而使pH有所升高，从而导致牛链球菌的数量降低;牛链球菌生长被抑制将进一步降低乳酸的产生量，从而改善瘤胃发酵，使瘤胃菌群结构逐渐趋于平衡。

反刍兽新月单胞菌和埃氏巨型球菌是瘤胃内主要的乳酸利用菌。其中，反刍兽新月单胞菌可以利用累积的乳酸形成乙酸和丙酸，它还有脱羧基作用，能使琥珀酸脱羧基形成丙酸[24]，但反刍兽新月形单胞菌发酵乳酸的能力因可溶性糖的增加受到抑制[35]。埃氏巨型球菌可通过乳酸-丙烯酸和琥珀酸2条途径将乳酸分解为丙酸[36]，但在高精料饲粮情况下，乳酸-丙烯酸途径是其生成丙酸的主要途径。在高精料饲粮条件下，埃氏巨型球菌可以代谢掉70%的乳酸[37]，在饲喂高精料饲粮的绵羊瘤胃中，埃氏巨型球菌占乳酸利用菌总数的21%[38]。本研究表明，在逐渐提高饲粮精料水平的过程中，埃氏巨型球菌的数量急剧增加，但是当精料水平达到70%时，该菌的数量又急剧降低，而反刍兽新月单胞菌的数量在4种饲粮条件下差异不显著，原因可能是饲粮营养水平的适量提高促进了埃氏巨型球菌的增殖，但精料水平达到70%时，由于大量碳水化合物发酵产酸，pH显著降低，超过了埃氏巨型球菌耐受酸度的阈值，造成其数量急剧下降。而反刍兽新月单胞菌的数量变化差异不显著，可能是因为本试验所用底物为半纯合饲粮，含有大量的碳水化合物，抑制了该菌的繁殖。同时，本研究发现，添加硫胺素能极显著地提高埃氏巨型球菌的数量，说明硫胺素可通过促进乳酸利用菌的生长而改善瘤胃发酵，促进瘤胃菌群结构的平衡。

4 结论

①在高精料饲粮条件下，瘤胃内硫胺素微生物净合成量降低，发生亚急性瘤胃酸中毒。

②添加的硫胺素可通过改善瘤胃发酵，调节瘤胃菌群结构来缓解亚急性瘤胃酸中毒。

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