胰岛素对奶牛乳腺上皮细胞生长及κ-酪蛋白和胰岛素受体基因表达的影响

田 青 季 昀 庞学燕 王洪荣

(扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009)

在牛乳中，酪蛋白占总乳蛋白的80%，它包括αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白(κ-casein，CSN3)(它们的比例为 4∶1∶4∶1)[1]。在功能方面，牛乳中酪蛋白首先起到营养的作用，其次还有一个重要的功能就是稳定蛋白质，可以防止乳中蛋白质凝集和沉淀[2]。CSN3作为4种常见的酪蛋白之一，是唯一一种含有糖分、对钙不敏感的蛋白质。研究表明，牛CSN3基因具有3种基因型，其中AA型和AB型出现的频率较高，其中A等位基因在奶牛、肉牛或兼用型出现频率平均为80%(高产奶牛为88.9%，肉牛为75%)，AB型在奶牛上的出现频率较低(11.1%)，BB型在奶牛上的出现频率仅为5.6%。因此，CSN3基因，尤其是A等位基因在牛乳形成过程中是否表达和表达量的高低决定着牛乳中蛋白质含量的高低[3]。在大鼠上的研究表明，CSN3基因的表达对维持COP9信号小体(CSN)完整性、保证外胚层细胞存活、胚胎发育、维持乳腺细胞形态都是至关重要的，CSN3基因缺乏导致大鼠不哺乳幼鼠和丧失泌乳性能，因此是哺乳动物泌乳和繁殖所必需的[4-5]。另外也有研究表明，CSN3基因与骨髓瘤、肝癌等肿瘤细胞的发生有关，抑制CSN3基因表达可以引起生长受阻并诱导恶性细胞凋亡[6-7]。由此可见，CSN3基因是一个至关重要的基因，研究胰岛素(insulin，INS)对泌乳和乳蛋白合成的影响离不开此基因的作用。

前人研究表明，乳蛋白mRNA的合成和持续分泌是受泌乳激素调节的，其中泌乳素、糖皮质激素和胰岛素均起着主要作用[8]。胰岛素是机体内唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素，它的存在能够同时促进乳蛋白和非乳蛋白的合成，并和催乳素具有协同效应[9]。在调节蛋白质代谢方面，胰岛素一方面促进细胞对氨基酸的摄取和蛋白质的合成，另一方面抑制蛋白质的分解，因而有利于生长和生产。在体外研究发现奶牛乳腺上皮细胞的良好生长需要一定胰岛素水平的维持[10]。关于胰岛素的作用机理，有研究表明，胰岛素主要是通过促进乳腺酪蛋白基因转录来促进牛乳中蛋白质合成的，但对基因稳定性没有影响[11-12]，也有研究表明，胰岛素促进乳蛋白合成在Janus激酶-信号传导及转录激活因子(JAKSTAT)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路中都有作用，而这2个信号通路都与胰岛素亚基受体Ⅰ(IRS-Ⅰ)和胰岛素受体(INSR)有密切关系，INSR是一个完整的细胞膜糖蛋白，它是胰岛素与靶细胞结合过程中必不可少的，INSR对血糖平衡的调节作用离不开胰岛素的作用，如胰岛素信号在成骨细胞、β细胞和肝细胞中发挥作用必须要有胰岛素的分泌，以删除白色脂肪组织中INSR，使葡萄糖代谢增强[13]。催乳素和胰岛素的共同作用也离不开INSR[14]。在乳腺组织中胰岛素主要是激活 IRS-Ⅰ，其次是激活INSR后进入信号通路，通过配体的约束力和自磷酸化的诱导促使INSR蛋白位点生成，维持血糖平衡，进而促进乳腺上皮细胞泌乳[15-16]。由此可见，INSR基因是否表达和表达量的高低取决于是否有胰岛素存在或胰岛素的分泌量，而胰岛素作用效果好坏又取决于INSR基因是否表达或表达量多少，因此要研究胰岛素对乳蛋白合成基因CSN3的影响离不开对INSR基因的研究。本试验旨在以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为媒介，研究胰岛素对CSN3和INSR基因表达的影响，为深入阐明胰岛素的作用机理以及通过添加外源胰岛素调控奶牛乳腺乳蛋白的合成和分泌，进而提高牛乳中乳蛋白产量提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

生长培养基(DMEM/F12)、胎牛血清、催乳素、胰岛素转铁蛋白、表皮生长因子、氢化可的松、胰岛素、胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)均购自美国Gibco公司。主要仪器有电热恒温CO2培养箱(美国Thermo)、倒置显微镜(CKX41，日本Olympus)、超低温冰箱(美国 Thermo)、冷冻离心机(5415R型，德国Eppendorf)、常温低速离心机(上海卢湘仪公司)、PCR仪(ABI 2720型，美国ABI)、NanoDrop ND-1000浓度测定仪(美国Thermo)、实时定量 PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)仪(ABI 7500型，美国ABI)。

1.2 乳腺上皮细胞的获取

在扬州大学农牧场选择健康的泌乳期奶牛，采用无菌操作方式进行活体采样，采用酶消化法[17-18]获取乳腺上皮细胞，根据成纤维细胞与上皮细胞对胰蛋白酶耐受时间的不同及2种细胞贴壁速度的差异分离和纯化乳腺上皮细胞。对细胞中角蛋白-18进行鉴定后，用RT-qPCR方法检测奶牛乳腺上皮细胞的CSN3和INSR基因的表达量。

1.3 方法

1.3.1 细胞增殖测定

选用6代的细胞，复苏后等密度(约2 000个/孔)接种于96孔板，采用单因素5水平试验设计，分别用含有胰岛素0(对照)、5、50、500和5 000 ng/mL的生长培养基于37℃、5%CO2培养箱分别培养细胞 0、2、4、6、8、10、12、22、24、36、48、60和72 h，于酶标仪上读取吸光度值，每个处理设6个重复，同时设空白对照，周围一圈孔中加入磷酸盐缓冲液(PBS)用以缓解蒸发，具体操作流程参照碧云天生物技术研究所的试剂盒[Cell Counting Kit-8(CCK-8)]说明书。

1.3.2 CSN3和INSR基因表达量测定

选用4代的细胞，复苏后等密度接种于6孔板，待细胞长满70% ～80%时，先用无血清无激素含有双抗和两性霉素的生长培养基过渡16 h以上，采用单因素5水平试验设计，分别用含有胰岛素0(对照)、5、50、500 和 5 000 ng/mL 的生长培养基于37℃、5%CO2培养箱培养细胞24 h，每个处理设3个重复，每个试验独立重复3次。

用生长培养基培养24 h后收获细胞，用RNA提取试剂盒(RNAiso Plus，D9108A，日本TaKaRa)提取总 RNA，所有 RNA样品在 NanoDrop ND-1000浓度测定仪上测定OD260nm/OD280nm，用以检测总RNA浓度、纯度和完整性。提取的总RNA保存于-70℃。

以提取的总RNA为模板，用反转录试剂盒(PrimeScripRT Master Mix，DRR036A，日 本TaKaRa)制备cDNA，采用80 μL总反应体系。转录得到的RT-qPCR反应液4℃保存。

以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参基因，采用Primer 3软件进行引物设计，引物序列及参数见表1。

表1 引物序列及参数Table1 Secquences and parameters of primers

1.3.3 CSN3的相对含量测定

方法参照上海越研生物公司的牛CSN3 ELISA检测试剂盒的说明书。

CSN3的相对含量=100×CSN3的含量(ng/L)/总蛋白的含量(mg/L)。

1.4 数据统计与分析

所有原始数据先用Excel进行数据统计，用SAS 9.1中ANOVA进行显著性分析，Tukey法进行多重比较，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。结果用平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 胰岛素对奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响

由表2可见，0～2 h，各组细胞增殖差异不显著(P＞0.05)。在此之后继续培养，细胞的生长情况逐渐发生变化，在4 h，5、50和500 ng/mL组乳腺上皮细胞增殖显著高于对照组(P＜0.05)，5 000 ng/mL组与对照组相比差异不显著(P＞0.05)，但有高于对照组的趋势(P=0.098);6～24 h，5、50和500 ng/mL组细胞增长都极显著高于对照组和 5 000 ng/mL组(P＜0.01)，5 000 ng/mL组与对照组相比差异不显著(P＞0.05);从22 h开始，细胞生长进入稳定期。36 h以后，各试验组之间细胞增殖情况差异不显著(P ＞0.05)。

2.2 胰岛素对奶牛乳腺上皮细胞CSN3、INSR基因表达和CSN3相对含量的影响

经检验，各基因进行RT-qPCR时样品测定重复性好，且在40个循环之前已到达平台期，所以此反应条件可行，测定数据可信。

由图1可见，在培养液中添加胰岛素能够增加奶牛乳腺上皮细胞中CSN3基因的表达，各试验组CSN3基因的表达量均高于对照组，其中50 ng/mL组极显著高于 0、5和 500 ng/mL组(P＜0.01)，显著高于 5 000 ng/mL组(P＜0.05)。从总体趋势来看，胰岛素对CSN3基因表达的促进作用具有一定的剂量依赖关系，低剂量时随着添加量的增加，CSN3基因的表达量也随之增加，到达一定剂量后，随着胰岛素添加量的增加，CSN3基因的表达量反而下降，说明高剂量的胰岛素对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白的合成不利。

由图2可见，胰岛素对奶牛乳腺上皮细胞INSR基因表达的影响有着与CSN3基因有相同的趋势，即:低剂量时，随着添加剂量的增加，INSR基因的表达量也增加，超过50 ng/mL后，再随着剂量的增加，INSR基因的表达量反而下降，尤其是高剂量(5 000 ng/mL)的添加量使得INSR基因的表达量极显著地低于5和50 ng/mL组(P＜0.01)，显著低于对照组与500 ng/mL组(P＜0.05)。这也进一步证实了，胰岛素添加剂量过大对奶牛乳腺上皮细胞合成乳蛋白造成了不利影响。

表2 胰岛素对奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响Table2 Effects of INS on proliferation of bovine mammary epithelial cells

图1 胰岛素对奶牛乳腺上皮细胞CSN3基因表达的影响Fig.1 Effects of INS on the expression of CSN3 gene in bovine mammary epithelial cells

CSN3含量测定的标准曲线为Y=0.000 6X-0.171 3(R2=0.973 4，图3)。由图4可见，胰岛素能显著增加奶牛乳腺上皮细胞CSN3的相对含量，各试验组均极显著高于对照组(P＜0.01)。各试验组之间，50 ng/mL组效果最好，其CSN3的相对含量极显著地高于5和500ng/mL组(P＜0.01)，显著高于5 000 ng/mL组(P＜0.05)。

图2 胰岛素对奶牛乳腺上皮细胞INSR基因表达的影响Fig.2 Effects of INS on the expression of INSR gene in bovine mammary epithelial cells

2.3 胰岛素浓度与奶牛乳腺上皮细胞CSN3和INSR基因表达量以及CSN3相对含量的相关性分析

由表3可知，胰岛素浓度≤50 ng/mL时，CSN3基因表达量与胰岛素浓度间无显著相关(P＜0.05);INSR基因表达量与胰岛素浓度间(P＞0.05);CSN3相对含量与胰岛素浓度间呈显著正相关(P＜0.05)。胰岛素浓度≥50 ng/mL时，CSN3基因表达量与胰岛素浓度间无显著相关(P＞0.05);INSR基因表达量与胰岛素浓度间有呈负相关的趋势(P=0.054);CSN3相对含量与胰岛素浓度间无显著相关(P＞0.05)。胰岛素浓度在0～5 000 ng/mL时，INSR基因表达量与胰岛素浓度间呈显著负相关(P＜0.05);CSN3基因表达量、CSN3相对含量与胰岛素浓度间均无显著相关(P＞0.05)。

图3 CSN3含量标准曲线Fig.3 The standard curve of CSN3 content

图4 胰岛素对奶牛乳腺上皮细胞CSN3相对含量的影响Fig.4 Effects of INS on the relative content of CSN3 in bovine mammary epithelial cells

2.4 胰岛素浓度与奶牛乳腺上皮细胞CSN3和INSR基因表达量以及CSN3相对含量的的回归分析

以胰岛素的不同浓度0、5、50、500 和5 000 ng/mL为自变量(X)，分别与CSN3、INSR基因表达量和CSN3相对含量(因变量，Y)之间进行回归分析，结果表明CSN3、INSR的基因表达量和CSN3相对含量与胰岛素浓度间呈二次方曲线关系。方程(图5)如下，CSN3基因表达量:Y=0.122 4X2+0.812 5X+0.260 1(R2=0.282 4)，回归关系不显著(P=0.718);INSR基因表达量:Y=0.12X2+0.645 6X+0.479 7(R2=0.996 0)，回归关系极显著(P＜0.01);CSN3相对含量:Y=-24.062X2+159.62X-101.05(R2=0.409 2)，回归关系不显著(P=0.771)。

3 讨论

影响奶牛乳腺上皮细胞乳的合成和品质，尤其是乳蛋白合成的因素很多，如遗传、营养、环境与管理、激素与生长因子等，其中影响乳蛋白合成的主要激素有胰岛素、糖皮质激素、催乳素、孕激素、生长激素等，近年来对影响奶牛乳腺上皮细胞中蛋白质合成因素的研究主要集中在对细胞中酪蛋白和乳清蛋白的检测上[20-21]，而其调控机理也集中在3个方面:一是血流量，研究发现血流量为激素对乳腺乳蛋白合成的主要调控点，胰岛素能够增加乳腺对氨基酸和葡糖糖的摄取率，增加血流，进而增加乳蛋白的含量[22]。二是细胞信号通路，其中mTOR是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[23]。mTOR是细胞内多种重要信号传导通路的调控蛋白，调控着细胞翻译起始、转录、蛋白合成及降解功能，进而调节细胞的生存、增殖和凋亡等细胞重要环节[24]。激素作为生长因子之一主要是通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/mTOR通路实现的[25-26]。另外，胰岛素在JAK-STAT信号通路中主要是激活IRS-Ⅰ，通过配体的约束力和自磷酸化的诱导，促使INSR蛋白位点的生成，从而促进乳腺上皮细胞乳的生物合成[27]，但是似乎不管哪条信号通路发挥作用都离不开激素受体。三是通过激素来调节乳腺上皮细胞的增殖、凋亡和免疫来调节泌乳和乳蛋白的合成[28-35]，这方面的作用就目前的研究来看主要集中在催乳素、生长激素和一些调节因子如胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)等上面，如生长激素可以通过营养重分配和维持奶牛乳腺细胞功能来促进奶牛乳腺β-酪蛋白基因表达[36]，糖皮质激素和催乳素可以诱导β-酪蛋白基因表达，乳腺组织相关生长因子活性功能的发挥也需要催乳素的存在[37]，催乳素缺乏造成产奶量下降，但外源添加催乳素和生长激素则可以提高产奶量[38]，下调INSR可以抑制癌细胞的增殖和转移[39]等。近年来关于胰岛素在这方面的作用，尤其是关于作用机理的研究目前尚未不多见，关于胰岛素的研究似乎还停留在早期的体内研究，如奶牛体内低的胰岛素浓度有增加奶牛间情期发病的危险，粒层细胞上胰岛素及其受体浓度的改变会影响卵泡生长和类固醇的生成[40]，因此推测奶牛乳腺组织中胰岛素及其受体的改变也会影响乳腺生长和乳蛋白的合成且作用也与其他泌乳激素具有相同的作用机制。因此本试验主要以奶牛乳腺上皮细胞为载体，通过不同剂量外源胰岛素对奶牛乳腺上皮细胞增殖、CSN3和INSR基因表达量影响分析，旨在了解胰岛素本身对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成相关基因的影响，为进一步而阐明胰岛素的作用机理奠定基础。

表3 胰岛素浓度与奶牛乳腺上皮细胞CSN3和INSR基因表达量以及CSN3相对含量的相关系数Table3 Correlative coefficient among INS concentration，expressions of CSN3 and INSR genes and the relative content of CSN3 in bovine mammary epithelial cells

图5 胰岛素浓度与奶牛乳腺上皮细胞CSN3和INSR基因表达量以及CSN3相对含量的回归分析Fig.5 Regression analysis among INS concentration，expressions of CSN3 and INSR genes and the relative content of CSN3 in bovine mammary epithelial cells

3.1 胰岛素对奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响

胰岛素在体外能够促进细胞的增殖和分化，在体内也是一种重要的生长调节因子，在细胞水平上它主要是通过与细胞膜上的受体相结合而发挥作用，浓度较高时也能够被IGF-Ⅰ受体激活，胰岛素能够促进细胞的增殖又能通过INSR的作用抑制白血病细胞增殖[41]。Andrea 等[42]用不同浓度胰岛素(10～10 000 ng/mL)作用于 HL-60、U937、ML-1细胞48 h后，结果显示，10 ng/mL的胰岛素可促进细胞增殖，随着浓度增高，促增殖作用增强，各细胞系的最佳促进浓度不一，进一步加大浓度(＞1 000 ng/mL)，促增殖作用逐渐减弱。陈彦如等[43]研究发现胰岛素对Reh细胞具有浓度和时间依赖性的促增殖作用，当胰岛素浓度为1×10-9mol/L时其促增殖作用最强，与对照组相比，胰岛素有明显的促增殖作用。王耀辉等[44]以大鼠血管内皮细胞(vascular endothelial cell，VEC)为模型，研究了不同浓度胰岛素对VEC增殖过程中INSR和FK506结合蛋白12(FKBP12)基因表达的影响，发现超过大鼠生理水平的胰岛素使INSR和FKBP12基因的表达量低于对照，说明高浓度的胰岛素可使VEC对生理浓度胰岛素的反应性降低，该胰岛素抵抗状态至少维持24 h。本试验研究结果表明，随着胰岛素浓度的增加，胰岛素促细胞生长作用逐渐增强，当超过50 ng/mL时促增殖作用逐渐减弱，并且随着作用时间的延长促生长作用逐渐增强，到了22 h以后进入平台区，趋于稳定，超过48 h以后促增殖作用逐渐减弱，这与以上研究结果基本一致，其原因一方面是胰岛素的浓度过大造成奶牛乳腺上皮细胞胰岛素反应性降低，INSR基因表达量减少，进而使胰岛素作用减弱;另一方面随着时间的延长，培养液中的营养成分逐渐耗尽，细胞的生长也受到了一定的限制，进而生长减缓甚至停止生长。

3.2 胰岛素对奶牛乳腺上皮细胞CSN3、INSR基因表达和CSN3相对含量的影响

在体内，Molento等[40]研究发现静脉注射胰岛素能够提高乳蛋白和酪蛋白的含量，降低乳中尿素氮的含量，Comin等[45]研究发现，CSN3和 β-酪蛋白基因对产奶量、牛乳凝固特性和乳蛋白产量影响很大，而对乳中脂肪、蛋白质比例和其他质量特性影响不大，似乎CSN3基因对牛乳稳定性方面的作用更显著一些，但在山羊研究发现BB型和AB型比AA型CSN3基因与总酪蛋白和乳蛋白的含量具有更高的相关性[46]。Léonard 等[47]给荷斯坦奶牛体内每小时灌注2.5 IU胰岛素+50 g葡萄糖发现，奶牛活体日增重增加了0.65 kg，乳蛋白产量比生理盐水灌注组和葡萄糖灌注组分别增加了11%和14%。乳腺静脉注射胰岛素(每小时1.0 μg/kg BW)和胰岛素+支链氨基酸均显著增加了乳中酪蛋白含量，分别增加了15%和 25%[48]。

在体外，陈建晖等[10]以奶牛乳腺上皮细胞系为基础研究了胰岛素、催乳素及孕酮对乳腺上皮细胞泌乳机能的影响，结果表明，在培养液中添加胰岛素后72 h内，随着培养时间的延长，细胞中酪蛋白含量升高不明显而培养液中酪蛋白的分泌明显升高。佟慧丽等[49]用添加有胰岛素的培养基培养细胞48 h发现对照组与胰岛素组细胞总蛋白分泌水平差异不大。研究表明，胰岛素可以协同氢化可的松和催乳素促进乳蛋白相关基因的表达和乳蛋白的合成，胰岛素单独存在对乳蛋白相关基因的表达也起着很关键的作用[50-51]。

本试验在添加胰岛素后进行了为期24 h的培养发现，各组CSN3基因的表达量均高于对照，其中添加胰岛素50 ng/mL组极显著高于0、5和500 ng/mL组，显著高于5 000 ng/mL组，这与陈建晖等[10]的研究结果不太一致，这可能是由于在他们的试验中随着培养时间的延长，细胞中酪蛋白分泌到了培养液中造成的。而在佟慧丽等[49]的试验中，由于没设对照组(对照组细胞不能贴壁)，所以各组间总蛋白分泌水平差异不大，本试验则是先用完全培养基促使细胞贴壁后，经过16 h以上的过渡，采用含有不同浓度胰岛素的生长培养基培养的，所以与对照组相比有差异。从CSN3的相对含量来看，胰岛素能显著增加奶牛乳腺上皮细胞CSN3的相对含量，各试验组均极显著高于对照组。各试验组之间，50 ng/mL的添加剂量效果最好，其 CSN3的相对含量极显著地高于5和500 ng/mL组，显著高于5 000 ng/mL组，这与前人研究结果基本一致，说明添加胰岛素能够显著促进奶牛乳腺上皮细胞中CSN3的合成并促进其分泌。

Kong等[52]2008年研究确定 INSR是天然产物黄连素增加胰岛素活性的靶点，他们发现在培养的人得肝细胞中，在有胰岛素存在时，黄连素能增加INSR基因表达量和蛋白合成量，当INSR基因被沉默时，这种效应减弱，说明胰岛素要发挥作用离不开INSR。INSR能够反映人生理胰岛素浓度[53]。胰岛素对奶牛乳腺上皮细胞INSR基因表达的影响趋势基本与对CSN3基因表达的影响相同，即低剂量时，随着胰岛素添加剂量的增加，IN-SR基因的表达量也增加，超过50 ng/mL添加量后，再随着剂量的增加，INSR基因的表达量反而下降，尤其是高剂量(5 000 ng/mL)的添加量使得INSR基因的表达量极显著地低于其他各试验组。从本试验结果的总体趋势来看，胰岛素对CSN3和INSR基因表达的促进作用具有一定的剂量依赖关系，低剂量时随着添加量的增加，CSN3和INSR基因的表达量也随之增加，到达一定剂量后，在随着胰岛素添加量的增加，CSN3和INSR基因的表达量反而下降，说明高剂量的胰岛素对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白的合成不利，这与胡小丽等[54]在奶牛乳腺上皮细胞Fc受体(FcRn)基因上的研究结果一致，也与之前的推测相吻合，说明胰岛素的确可以通过改变INSR浓度进而影响乳蛋白合成。可能的原因是高剂量的胰岛素抑制了其受体基因的表达，进而阻止了PI3K-mTOR和JAK-STAT信号通路，使乳蛋白的合成受到了抑制，这个原因还需要进一步测定2个信号通路中的相关指标来进一步确定。通过本试验的相关分析和回归分析可见，当培养液中胰岛素浓度≤50 ng/mL时，胰岛素浓度与CSN3和INSR基因的表达量均呈正相关，胰岛素浓度≥50 ng/mL时，胰岛素浓度与CSN3和INSR基因的表达量均呈负相关;在0～5 000 ng/mL之间，INSR基因表达量与胰岛素浓度间呈显著负相关，而CSN3基因表达量与胰岛素浓度间呈正相关，CSN3相对含量与CSN3基因表达量一致。这不但证实了高剂量的胰岛素能够抑制其受体基因的表达，添加胰岛素能够促进CSN3基因的表达和CSN3的合成，而且也提出了新问题，即:虽然胰岛素能够促进CSN3基因的表达和CSN3的合成，但是CSN3基因的表达和CSN3的合成却并不和INSR基因表达趋势一样呈显著的二次方的曲线回归关系，这暗示胰岛素对CSN3基因表达的影响并不完全是通过INSR这一条通路完成的，其机制(尤其是胞外)还有待进一步研究。另外，在以后的研究中，应该更加深入的从CSN3基因的不同基因型着手，综合考虑牛乳稳定性等因素，得到更加准确和贴近生产实际的结果来指导生产。

4 结论

随着胰岛素浓度的增加，CSN3和INSR基因的表达量及CSN3相对含量均呈先增加后下降的趋势，50 ng/mL时最高，而高浓度(5 000 ng/mL)的胰岛素不利于奶牛乳腺上皮细胞合成乳蛋白。

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